斜纹夜蛾两种乙酰胆碱酯酶基因的分子特性及功能分析

Acetylcholinesterase (AChE) play important roles in insect central and peripheral nervous systems, and the enzymes are also the major target of organophosphates and carbamates insecticides against insects. To date, both Ace1 and Ace2 have been identified from more than 30 insect species. However, the functions of Ace1 and Ace2 have not yet been eluciated in insect. Hence, verification of the function of two Ace genes in insects has become one of the hotspots in the field of insect toxicology.The objectives of this project is to: 1)clone and sequence the full-length cDNAs of two Ace genes in the Spodoptera litura, 2) profile the developmental- and tissue-specific expression patterns of Ace1 and Ace2 genes of S.litura, and 3) investigate the biological and toxicological functions of each Ace gene by using the RNA interference (RNAi) technique. The results would be very helpful for the good understanding of the two Ace genes' functions in insects,and provide a theoretical basis for the development of novel highly selective insecticides.

乙酰胆碱酯酶（AChE）是昆虫神经传递系统的关键酶，也是有机磷酸酯类和氨基甲酸酯类杀虫剂的作用靶标。目前已发现三十多种昆虫体内存在两种AChE基因（Ace1和Ace2），但关于昆虫这两种基因的功能差异报道并不多。明确Ace1和Ace2基因各自编码的AChE功能已成为昆虫毒理学领域的研究热点之一。本研究以斜纹夜蛾为对象：（1）克隆斜纹夜蛾体内Ace1和Ace2基因全长序列，并进行分析、明确其分子特性；（2）分别比较斜纹夜蛾不同发育阶段及不同组织部位Ace1和Ace2基因mRNA表达水平；（3）应用RNAi技术研究Ace1和Ace2基因所具有的生物学和毒理学功能，从基因水平明确有机磷酸酯类和氨基甲酸酯类杀虫剂的具体作用靶标。通过上述研究，最终阐明斜纹夜蛾两种Ace基因的分子特性及功能差异，完善鳞翅目害虫两种Ace基因的功能研究，为新型选择性杀虫剂开发提供理论依据。

本研究在建立了斜纹夜蛾cDNA文库及Ace基因全长序列的基础上，分析了Ace基因的分子特性；筛选了不同实验条件下斜纹夜蛾稳定的内参基因；进而分析了Ace基因的时空表达谱；并通过RNAi实验，对两种Ace的功能进行了研究。发表SCI论文2篇，培养博士后1人，硕士研究生1人。顺利完成了项目计划任务。. 本研究结果表明：斜纹夜蛾Ace1基因cDNA全长2085bp，编码695个氨基酸，Ace2基因cDNA序列全长1917bp，编码639个氨基酸，均具有Ace基因的特征结构域。系统发育树分析表明：斜纹夜蛾Ace1和Ace2基因分别属于昆虫Ace1和Ace2两个不同的分支，且Ace1与烟青虫Ace1同源性最高，Ace2与小菜蛾Ace2同源性最高。此外，分析评价了斜纹夜蛾在不同实验条件下稳定的内参基因：发育时期，GAPDH和UCCR；不同组织，RPL10，AK和EF1；不同种群，RPL10和EF1；温度处理，GAPDH和EF1；药剂处理，AK和ACTB；不同食物饲喂处理，RPL10，GAPDH和UCCR；饥饿处理，RPS3和ACTB。此结果对于斜纹夜蛾中基因表达分析具有重要意义，并且为进一步分析斜纹夜蛾和其他生物内参基因稳定性奠定了基础。在此基础上，测定了两种Ace基因在斜纹夜蛾不同发育时期和不同组织的表达量：两种Ace基因在斜纹夜蛾不同发育时期均有表达，且在脑部组织的表达量远高于其他组织。Ace2基因的表达高于Ace1基因，这与鳞翅目家蚕中的表达情况类似。RNAi研究Ace基因功能的实验结果表明：抑制Ace基因表达，一定程度提高了斜纹夜蛾的死亡率，抑制了其生长发育，且抑制Ace1基因时，这种作用更为明显。毒力测定结果显示：单独抑制Ace1基因表达和共同抑制Ace1和Ace2表达时，斜纹夜蛾对药剂敏感度显著提高；单独抑制Ace2表达时，试虫对药剂敏感度也有所提高，但是与对照组无显著差异。因此，我们初步认定斜纹夜蛾Ace1基因是有机磷和氨基甲酸酯类药剂的主要作用靶标，而Ace2基因的缺失一定程度上影响了斜纹夜蛾的生长发育。这些结果为挖掘AChE的新功能奠定了基础，具有重要的生理及毒理学意义。