从HIF1-α/IL-8/VEGF信号通路探讨熊胆粉抑制原发性肝癌TACE术后血管新生的作用及机制

Transcatheter arterial chemoembolization (TACE) is one of the main therapies for primary liver cancer. However, the expression of hypoxia inducible factor (HIF) -1α was up-regulated in the tumor microenvironment after TACE, and thereby increasing vascular endothelial growth factor (VEGF) which promotes the tumor angiogenesis, which promoted the recurrence and metastasis of tumor. In addition, TACE could cause elevation of IL-8 levels. IL-8 also promotes VEGF expression and angiogenesis through HIF-1α dependent / independent pathways. After TACE, the incompletion of tumor necrosis, and the increase of VEGF and tumor angiogenesis result in unsatisfied long-term effect. Bear gall powder is reported to be able to inhibit angiogenesis in vitro. Our previous study found that bear gall powder can down-regulate IL-8 levels after TACE, and inhibit the expression of HIF-1α secreted by hepatocellular carcinoma cells under hypoxia, suggesting that it may inhibit angiogenesis after TACE. Therefore, we hypothesized that bear gall powder can inhibit angiogenesis after TACE by targeting HIF-1α /IL-8/VEGF pathway, and thereby improve the curative effect of TACE. Therefore, we aimed to investigate the angiogenesis inhibition effect and underlying mechanisms of bear gall powder after TACE, which may provide experimental basis for the further improvement of TACE effect.

经动脉化疗栓塞（TACE）是原发性肝癌的主要疗法之一。但TACE术后肿瘤局部缺氧上调缺氧诱导因子（HIF）-1α表达，进一步通过诱导血管内皮生长因子（VEGF）升高促进肿瘤血管生成，进而促进肿瘤复发转移。此外，TACE还能引起IL-8水平升高。IL-8通过HIF-1α依赖/非依赖途径促进VEGF表达及血管新生。TACE术后肿瘤坏死不彻底、VEGF升高促进血管新生等问题使其远期效果欠佳。我们前期研究发现熊胆粉能够下调TACE术后IL-8水平，体外抑制缺氧条件下肝癌细胞HIF-1α及VEGF表达，提示其可能有抑制TACE术后血管新生的作用。因此，我们提出假设：熊胆粉能够靶向HIF-1α/IL-8/VEGF通路，抑制TACE术后血管新生，进一步提高TACE疗效。因此，我们拟通过本课题明确熊胆粉抑制TACE术后血管生成的作用及机制，为进一步提高TACE术的疗效提供实验依据。

血管新生是肿瘤生长及转移的重要原因。缺氧和炎症是肝癌微环境中两大重要特征。肝癌的肿瘤负荷、治疗方式包括TACE术等，均促使肝癌处于缺氧微环境并导致复发转移。我们前期的研究发现，熊胆粉（BBP）能有效肝癌肝癌患者TACE术后的炎症反应及预后，其机制可能与抑制IL-8的上调有关。本研究中，我们通过CoCl2及缺氧培养箱培养建立缺氧模型，发现BBP能有效抑制缺氧条件下肝癌诱导的血管新生，其机制与抑制HIF-1α, VEGF和IL-8的表达相关，其中以IL-8的效应最明显。进一步研究发现BBP亦能有效抑制IL-8诱导的血管生成，且该实验结果得到体内验证。我们进一步对BBP的有效成分牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）和熊去氧胆酸（UDCA）进行筛选，发现UDCA是BBP的主要有效成分。通过MTT实验选取对肝癌细胞和内皮细胞增殖抑制作用不明显的UDCA的浓度（低于100 μM），通过Huh 7和EA.hy 926细胞共培养体系，发现与Huh 7细胞共培养能促进血管新生，而缺氧条件下的肝癌细胞对血管生成促进作用更为明显，但该效应能被不同浓度的UDCA（25和50 μmol/L）所拮抗。ELISA实验结果显示，CoCl2能显著促进Huh 7细胞IL-8和VEGF的分泌，提示缺氧条件下肝癌细胞可能通过增加IL-8和VEGF的分泌在促进血管的生成，而不同浓度的UDCA（25和50 μmol/L）均能抑制缺氧条件下IL-8和VEGF的分泌。通过人重组IL-8细胞因子干预EA.hy 926细胞，结果显示，IL-8能促进血管的生成，而不同浓度的UDCA均能抑制IL-8诱导的血管生成，该效应被体内实验验证。另外，我们发现缺氧能促进HIF-1α mRNA和蛋白水平的表达，而不同浓度的UDCA均能抑制缺氧诱导的HIF-1α高表达。通过质粒转染过表达HIF，结果进一步验证了HIF过表达的Huh 7细胞较正常对照细胞其IL-8和VEGF mRNA的表达水平更高，且促进了缺氧条件下的血管生成，而UDCA能有效拮抗该效应，推测UDCA抑制缺氧诱导的血管生成可能与HIF-1α/IL-8和VEGF信号通路相关。在缺氧条件下，HCC细胞中ERK和AKT的磷酸化明显增加，而UDCA抑制了这一磷酸化。推测UDCA通过上述通路最终抑制了ERK和AKT的激活进而抑制了缺氧条件下的血管新生。