弓形虫SCD在硬脂酸代谢中的作用机制研究

It is essential for Toxoplasma gondii to de novo synthesize fatty acid by type Ⅱ fatty acid synthetase (FASⅡ) in its growth and reproduction. However，it is not clear the Toxoplasma gondii unsaturated fatty acid is completely synthesis by itself or obtain from the host cell. Stearic acid uses stearoyl CoA desaturase (SCD) catalyzes oleic acid in organism, but the expression, localization and function of SCD in Toxoplasma gondii are unknown. Our previous research found that SCD gene exist in Toxoplasma gondii genomic DNA. This project proposed to clone TgSCD and express protein by bioinformatics analysis; proving expression of TgSCD by Real-time PCR and immunoblotting; localization of TgSCD by by indirect immunofluorescence and fluorescent tracer. Identification the function of TgSCD with specific inhibitors. By knock out and transfection technology, changes of biological characteristics and the pathogenicity to mice of T. gondii are observed when TgSCD is knocked out or over expressed. Reveal the role of endogenous TgSCD in the fatty acid metabolism. It is possible to find new targets of anti-Toxoplasma drugs, and to provide new ideas for the prevention and control of toxoplasmosis.

弓形虫的生长繁殖必须利用II型脂肪酸合成酶（FAS）合成脂肪酸，但弓形虫的不饱和脂肪酸是完全需要自身合成还是可以从宿主细胞获取尚不清楚。生物体内的硬脂酸必须利用硬脂酰CoA去饱和酶（SCD）催化生成油酸，但对弓形虫SCD的表达、定位、功能及作用机制尚未认知。我们前期研究发现弓形虫基因组中存在SCD基因，本项目拟通过生物信息学分析，获取SCD的相关信息，进行基因扩增和蛋白表达，采用Real-time PCR和免疫印迹等技术验证SCD在虫体中的表达；采用间接免疫荧光和荧光示踪技术进行虫体内SCD亚细胞定位。应用酶抑制剂初步确定SCD在虫体中的功能后，通过基因敲除和转染技术分别构建基因缺失株、补足株和过表达株，观察酶基因缺失、功能抑制和过表达时，虫株生长、繁殖等的变化及对小鼠毒力的影响，揭示弓形虫内源性SCD在其脂肪酸代谢中的作用机制，有可能发现抗弓形虫药的新靶点，为弓形虫病的防控提供新思路。

硬脂酰辅酶A去饱和酶（stearoyl-coenzyme A desaturase, SCD）是不饱和脂肪酸合成关键酶。分析发现弓形虫中存在与疟原虫SCD相似性达54%的推定脂酰辅酶A去饱和酶基因（ToxoDB编号TGGT1_238950），该基因编码的蛋白质具有典型的去饱和酶结构域。通过反转录PCR获得弓形虫该基因的3129 bp全长编码序列，与TGGT1_238950的序列完全一致。原核表达并制备鼠源抗体，蛋白印迹显示弓形虫速殖子中存在与预期相符一致的蛋白表达，分子量约为120 kDa。通过构建带有HA标签的该基因内源性标记虫株，确认虫体内源性蛋白定位于内质网，与其他生物细胞的去饱和酶定位一致，推定该蛋白为弓形虫的硬脂酰辅酶A去饱和酶（TgSCD）。.环丙烯脂肪酸（如苹婆酸）是SCD的抑制剂。我们选择苹婆酸以及几种与其结构相似的甲酯化物作用于细胞培养中的弓形虫，发现它们都能不同程度抑制胞内弓形虫的增殖与释放。其中含有甲氧基的编号INT21药物对弓形虫有明显抑制作用，且对宿主细胞毒性较小，能够显著抑制Pru株感染小鼠的脑荷虫量。.运用CRISPR/Cas9技术条件性敲除弓形虫TATi虫株的SCD。体外和体内实验均发现敲除SCD后，虫体的入侵、发育、繁殖以及对小鼠的致病性等无明显变化，提示虫体生长发育对SCD的依赖程度不高，或有其它因子替代或补偿其功能。弓形虫SCD过表达虫株的入侵细胞的能力降低，增殖速度减慢，对小鼠的致病性下降。SCD过表达虫株的油酸比例增加，证明弓形虫SCD在虫体内发挥了脂肪酸去饱和酶的功能；SCD过表达虫株发生内质网应激，更易发生自噬和凋亡。.本项目研究确认了弓形虫中存在SCD，且能够发挥脂肪酸去饱和酶的功能，参与了虫体自噬；但弓形虫SCD的缺失对速殖子阶段的生长繁殖没有显著影响，提示存在其它物质补偿其功能。