葛花解酲方协同抑制VEGF和Wnt信号通路阻断乙醇性HBV转基因小鼠肝癌微环境血管新生的作用机制

The incidence of Primary liver cancer increases year by year, HBV infection and alcoholic liver disease are the two major risk factors. The tumor microenvironment has been considered as a precancerous condition or key therapeutic target for HCC patients, it is an important strategy used as to prevent tumor progression to block the growth of new blood vessels in liver microenvironment. The advantages of traditional Chinese medicine in the treatment of liver cancer get more and more attention. Previous studies have shown that Gehuajiecheng Decoction can regulate Vascular smooth muscle cell proliferation factor such as p27 and important molecules in Wnt signal pathway, like APC. So we put forward the scientific hypothesis based on this: Gehuajiecheng Decoction may inhibit liver cancer development by coregulating VEGF and Wnt signal transduction pathway, improving the liver microenvironment and blocking the vascular newborn. The research group introduces innovatively the visualization technology of vivo microcirculation dynamic coordinated with vivo optical imaging technology and couples with the morphology, molecular biology methods, which makes us more stereoscopic, intuitive, and systematic to evaluate that how dose Gehuajiecheng Decoction inhibit the angiogenesis of liver microenvironment in ethanol HBV transgenic mice, and to explore its molecular mechanism of regulation of VEGF and Wnt signaling pathway synergisticly. We even explain the effect of dysfunction of liver storeing blood and governing free flow of qi on liver cancer from a new perspective of microenvironment of the liver angiogenesis, which riches the scientific connotation of the Zang theory.

原发性肝癌发病率逐年上升，HBV感染和乙醇性肝病是其两大危险因素。肿瘤微环境已被作为癌前状态或HCC患者的关键性治疗靶点，阻止肝脏微环境中新生血管生长可作为阻止肿瘤进展的一项重要策略。中医药在肝癌治疗上的优势越来越受到重视。前期研究表明，葛花解酲方可调控p27等血管平滑肌增殖因子以及APC等Wnt信号通路重要分子。基于此提出科学假说：葛花解酲方可能通过协同调控VEGF和Wnt信号转导通路、改善肝脏微环境、阻断血管新生，达到抑制肝癌发生发展的作用。课题组创新性引入微循环活体动态可视化技术配合活体光学成像技术，再加上形态学、分子生物学方法，更立体、更直观、更系统地评价葛花解酲方对乙醇性HBV转基因小鼠肝脏微环境血管新生的抑制作用，探讨其协同调控VEGF和Wnt信号通路的分子机制；并从肝脏微环境血管新生的新视角去阐释“肝藏血主疏泄”功能失常对肝癌的影响，丰富臧象理论的科学内涵。

1.项目背景及意义：HBV感染和乙醇性肝病是其两大危险因素。肿瘤微环境已被作为癌前状态或HCC患者的关键性治疗靶点，阻止肝脏微环境中新生血管生长可阻止肿瘤的进展。基于前期研究，提出科学假说：研究基于中医学“治未病”理论，通过“肝藏血主疏泄”理论，葛花解酲方可能通过协同调控VEGF和Wnt信号转导通路、改善肝脏微环境、阻断血管新生，达到抑制肝癌发生发展的作用。这对于丰富中医臧象理论的科学内涵具有重要意义。.主要研究内容：（1）通过 IVIS 成像系统长期监测肿瘤的生长；（2）体外检测对Hepa1-6细胞、原代巨噬细胞表型（M1、M2)的影响及其水提液物质组份。（3）建立乙醇HBV双因素所致肝癌癌前病变模型，观察葛花解酲方对小鼠癌前病变血清ALT、AST、GST、GGT活性，以及VEGF、MMP-9、TGF-β1、COX2、PI3K、AKT等的蛋白表达作用。（4）建立MHCC-97(H)-luc原发肝癌模型，检测肿瘤组织中CD31、VEGF双标血管的表达，以及Wnt/β-catenin相关蛋白表达。（5）建立二乙基亚硝胺诱导肝癌模型，评估肝癌结节数、发生率、病变面积；检测免疫微环境中CD4、CD8细胞、TAMs、MDSC的表达；检测IL-6、IL-10、TNF-β、CCL-2、CD31 以及WNT1、β-catenin、FRZ-7、APC、VEGF1、NF-kB、p-MAPK、p-AKT、p-SRC的表达。.3.重要结果：①葛花解酲方能够下调ALT、AST、GST、GGT活性。②葛花解酲方可降低裸鼠肝脏内荧光发光强度。③葛花解酲方能够减少双标血管数目，能够降低肝癌变率、肝表面癌结节数、肝癌变面积比。④能够下调肝癌组织内WNT1、MMP-2、β-catenin、Frz-7、VEGF1、NF-κBP65、p-MAPK、Akt、Src、p-AKT、p-SRC蛋白的含量，下调CD4+Tregs、CD8+Tregs、TAMs、MDSCs、CD31、IL-6、IL-10、TNF-β、CCl-2的表达，提高肝癌组织内 CD8+T细胞、CD8+Tem、CD8+Tcm、APC蛋白的表达；⑤葛花解酲方能够抑制 Hepa1-6的增殖、抑制 M2 型巨噬细胞转化，提高M1型巨噬细胞的表达；⑥葛花解酲方水提液中有很多抗癌、抑制炎症及血管形成的物质组分。