三子固本方活性多糖经Nrf2信号通路对TGF-β1/Smad介导的糖尿病肾病EMT的作用机制研究

Recently, emeraging evidences showed that epithelial-to-mesenchymal transition(EMT) palys a significant role in tubulointerstitial fibrosis(TIF). We previously found that Sanziguben Granule could attenuate tubulinterstitial fibrosis and renal damage caused by Cyclosporine A(CSA) and diabetic nephropathy(DN) through suppressing EMT.These findings suggest a possible association with the activation of Nrf2 and anti-oxidative stress, but the mechanisms are still unclear.To confirm the role of EMT in DN, we plan to use gene microarray to examine db/db mice at different age; Meanwhile, by using the overexpression and knockdown of Nrf2 of cell models whether Nrf2 relates to TGF-β1/Smad signalling will be elucidated and the negative regulator of EMT will be explored by bioinformatics technology to predict and verify related target genes, and reveal the mechanism and molecular targets. These findings will provide novel potential methods for clinlical treament of DN. On the basis of above, We will explore effective polysaccharide of Sanziguben Granule against DN by suppressing EMT in vitro and in vivo experiments; Moreover, by using transfected cell models and transfected rat renal tissues with lentiviral vectors the mechanisims of Nrf2 and its downsteams target genes in DN EMT will be confirmed. The results of study will provide basises for a new potential traditional chinese medicine with EMT as target for prevention and treatment of chronic kidney diseases.

现有证据表明，EMT是肾小管-间质纤维化(TIF)发生发展的重要环节。我们前期工作发现，三子固本颗粒保护环孢素A和糖尿病肾病（DN）肾损伤、抗TIF与抑制EMT密切相关，其机制可能与激活Nrf2信号通路、抗氧化应激有关，但对具体作用机制及物质基础尚不清楚。本项目在科学假说导引下，拟利用基因芯片检测不同周龄自发DN小鼠，确定EMT在DN发生发展中的作用；建立稳定高表达和基因沉默Nrf2的细胞模型，确定Nrf2和TGF-β1/Smad信号通路的交互作用，利用生物信息学预测候选相关靶基因并验证，探索EMT的负性调节因子并阐明作用机制和分子靶标，为DN的临床治疗提供新的策略与方法。在此基础上，结合前期工作，从体内外实验追踪三子固本方抗DN EMT的活性多糖；利用细胞转染和慢病毒转染大鼠肾脏模型，明确Nrf2及下游靶基因在其中的作用机制，为开发以EMT为作用靶点防治慢性肾脏病的中药新药奠定基础。

上皮间充质转分化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）是糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy, DN）肾脏纤维化的重要环节，其在DN发展过程中的相关分子机制尚不明确。本项目以科学假说为出发点，完成三子固本方多糖（SZP）的分离及制备，采用化学诱导及自发型DN动物模型研究SZP部位对DN的治疗作用并阐明EMT在DN发生过程中的作用机制；建立Nrf2稳定低表达HK-2细胞，体外研究Nrf2在SZP抑制DN中肾脏组织发生EMT的靶点作用。研究结果发现，（1）STZ诱导的DN小鼠肾组织病理及相关指标检测结果表明DN小鼠肾脏发生炎症、氧化应激及EMT，EMT是肾脏纤维化的关键步骤，且炎症及氧化应激与EMT的发生密切相关。（2）DN小鼠Nrf2活化受到抑制，EMT发生过程中存在Nrf2抑制，表明Nrf2对EMT起负性调控作用。（3）对SZP化学结构表征发现其主要由葡萄糖、岩藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、甘露糖、核糖、半乳糖醛酸及葡萄糖醛酸构成；SZP的平均分子量为 2.268×106±4.297% kDa。（4）SZP对DN小鼠肾脏组织具有保护作用，SZP降低DN小鼠血糖，24h尿蛋白，降低小鼠血清BUN、Scr、TC及TG等肾脏功能指标，改善肾小球肾小管损伤及纤维化。（5）利用蛋白质免疫印迹检测发现SZP升高肾组织E-cadherin、ZO-1，抑制α-SMA、Vimentin表达，并且其伴随升高Nrf2及下游HO-1、NQO1，以及Smad7，抑制TGF-β及NF-κB信号通路活化，抑制炎症及氧化应激，减轻EMT及肾脏组织纤维化。（6）通过sh RNA构建了沉默Nrf2的稳转细胞株，明确了SZP抑制HK-2细胞EMT的发生，降低TGF-β，升高Smad7，是通过Nrf2信号通路发挥作用的。以上研究结果表明，SZP具有抑制DN中 EMT发生的作用，EMT是DN肾脏纤维化的关键步骤，Nrf2是EMT的负调控因子。SZP的保护作用与抑制炎症及抗氧化应激相关，其作用机制为激活肾脏Nrf2，抑制TGF-β介导的EMT相关通路，Smad7可能作为Nrf2通路与TGF-β信号通路交互作用的关键因子。该研究为临床上使用三子固本方提供了科学依据，同时为开发靶向EMT防治DN的药物开发奠定基础。