裂解性多糖单加氧酶的功能机理研究

Biomass is probably the main source of commodity chemicals in the future. The main component of biomass is cellulose. After converting to monosaccharide, cellulose can be transformed to various commodity chemicals and fuels through fermentation. However, cellulose hydrolases (CH) have low enzymatic activity toward crystalline cellulose. The low activity is the bottleneck for cellulose utilization. Lytic polysaccharide monooxygenase (LPMO) is a newly found enzyme which could oxidize cellulose and degrade it to smaller molecules. Its activity could complement that of cellulose hydrolases. Although there is growing interest in LPMO, its reaction mechanism remains elusive, which hinders the utilization and engineering of this enzyme. Structure biology studies reveal that a tyrosine and a histidine with 1-methyl modification are conserved, but their roles in the reaction are unknown. This study will use unnatural amino acids as EPR probe to study the redox change of tyrosine during reaction, and develop system for 1-methyl histidine (1-MeH) incorporation to compare the enzymatic activity of LPMO with and without 1-MeH. In the meantime, we will trap reaction intermediates through freeze-quench and stopped flow techniques, and study their structural and spectroscopic properties. Combining those three aspects, we hope to reveal the reaction mechanism of LPMO, a novel class of copper mono-oxygenase. Through study of mechanism, we will find ways to increase the activity and toward industrial application in biomass conversion.

生物质可能是未来的主要化工原料来源, 主要成分是纤维素。其转化为单糖后，可经生物发酵转化为各种原料和燃料。但是, 现有的纤维素水解酶(CH)对结晶态纤维素活性低，限制了纤维素的利用。裂解性多糖单加氧酶(LPMO)是最近发现的, 能氧化降解纤维素的酶,是CH的有效补充。目前学术界对LPMO的反应机理仍然不清楚，为有效利用和改造LPMO设置了障碍。结构生物学研究揭示了LPMO活性中心有保守的酪氨酸和1-甲基组氨酸（1-MeH），但这些残基的功能还是未知。本研究将使用非天然氨基酸作为电子顺磁共振光谱（EPR）探针，研究酪氨酸在反应过程中的氧化还原变化，并发展1-MeH的插入系统，研究这一独特的翻译后修饰的功能。同时，我们将通过捕捉反应中间体，研究它们的结构和光谱特性。通过这三方面的研究，我们希望解释LPMO这一全新的铜单加氧酶的反应机理，并通过机理研究找到提高酶活并最终应用在生物质转化中。

金属蛋白催化了生命活动中的很多重要反应，包括水氧化、氧气还原、固氮、二氧化碳固定等。这些金属酶的催化效率、选择性等往往超过了小分子催化剂，同时具有酶催化固有的反应条件温和、选择性高的特点。裂解性多糖单加氧酶(LPMO)是最近发现的, 能氧化降解纤维素的酶,是纤维素水解酶的有效补充。LPMO的结构功能研究不充分，反应机理不明确。对于LPMO的研究，有助于为这类酶的理性设计和实际应用提供指导。本项目首先发展非天然氨基酸作为电子顺磁共振光谱（EPR）探针，合成了多个结构与酪氨酸类似的非天然氨基酸，并筛选了一个新的氨酰tRNA合成酶，实现含巯基非天然氨基酸的定点引入；对一类模式铜蛋白，铜蓝蛋白进行了结构功能研究，通过构建圆排列突变突变体，证明与野生型蛋白的一级序列相差甚远的突变体的光谱、铜中心的结构与野生型的相似，建立了含铜蛋白电子自旋共振光谱、X射线吸收光谱表征的方法；在LPMO和模式蛋白中引入了作为电子顺磁共振光谱探针的非天然氨基酸，并记录了模式蛋白中自由基的电子顺磁共振谱图，初步探索了LPMO的反应机理；基于前期和项目进行期间在金属蛋白设计改造方面的基础，撰写了人工金属酶设计和蛋白质中氧化还原过程优化的系列综述。