肼合酶模型蛋白理性设计及其在微生物厌氧氨氧化中的应用

Anaerobic ammonium oxidation (anammox) is a novel route for ammonia degradation, catalyzing over 50% of dinitrogen generation on earth. Hydrazine synthase is a key enzyme in anammox, which combines ammonium and nitrite to form hydrazine. The structure of hydrazine synthase has been solved, but its catalytic mechanism remains elusive and activity is very low. These factors hinder the application of hydrazine synthase and anammox. Native hydrazine synthase is hard to extract and purify, and it contains multiple metal sites with overlap spectra, interfering mechanistic study. To overcome these issues, this study will design model protein from heme-containing domains in hydrazine synthase, which have low molecular weight and contain a single metal center. Heme in different model protein will be studied by spectroscopy, liquid chromatography and mass spectrometry, to reveal their function and catalytic activities, and catalytic mechanism of hydrazine synthase. The catalytic activity of model protein will be improved by introducing electron transfer proteins and other coupling enzymes. The most active hydrazine synthase model will be introduced into cell, to construct a microbial capable of degrading ammonium. This study can reveal the catalytic mechanism of hydrazine synthase, and facilitate the understanding and utilization of anammox process. In a final goal, we hope the engineering microorganism can degrade excess ammonia we introduced into the environment.

厌氧氨氧化过程是一种氨氮降解的新途径，合成了自然界中超过50%的氮气。肼合酶是厌氧氨氧化过程的关键酶，催化了氨与亚硝酸盐生成肼的反应。虽然肼合酶的结构已得到解析，但其催化机理仍不清楚、催化活性低，制约了肼合酶和厌氧氨氧化的应用。针对肼合酶天然蛋白提取纯化困难、多个金属中心互相干扰的问题，本研究将通过理性设计单独表达四个肼合酶含血红素结构域，构建分子量小、只有一个金属中心的模型蛋白。通过光谱、液相色谱、质谱等方法鉴定不同模型蛋白中血红素的功能及催化活性，揭示肼合酶的催化机理。通过引入电子传递蛋白等方法，提高模型蛋白的活性。最后将高效的肼合酶模型蛋白引入细胞中，构建降解氨氮的微生物。通过本研究可以阐释肼合酶的催化机理，有助于理解和利用厌氧氨氧化途径，降解人类活动引入环境的过量的氨氮。

厌氧氨氧化过程是一种氨氮降解的新途径，合成了自然界中超过50%的氮气。肼合酶是厌氧氨氧化过程的关键酶，催化了氨与亚硝酸盐生成肼的反应。虽然肼合酶的结构已得到解析，但其催化机理仍不清楚、催化活性低，制约了肼合酶和厌氧氨氧化的应用。针对肼合酶天然蛋白提取纯化困难、多个金属中心互相干扰的问题，本项目通过蛋白质设计的方法，从肼合酶的晶体选择含有c型血红素的结构域在大肠杆菌中重组表达，构建了分子量小（~12kD）、具有血红素活性中心天然构象的模型蛋白，对模型蛋白的催化活性与相互作用蛋白进行了研究。取得了以下研究进展：理性设计了四个肼合酶含血红素结构域的模型蛋白，成功表达纯化了对应肼合酶αI，αII，γII的HZS A1.3N，HZS A2，HZS C2模型蛋白；三种模型蛋白的紫外-可见光谱符合c型血红素蛋白的特征，取得了HZS A2的晶体结构，与天然肼合酶的相应结构域相似，证明设计的成功；HZS A1.3N，HZS A2，HZS C2的氧化还原电势符合其催化的反应，体外实验证明了HZS A1.3N可以催化肼的生成；通过人工智能结构预测的方法和Pulldown实验对肼合酶中与 HZS A2、HZS C2相互作用的蛋白质进行了鉴定，得到了3种可能向肼合酶传递电子的蛋白质。发表论文5篇并组织参加了一系列学术交流活动。本项目发现的模型蛋白可以为肼合酶的催化机制研究和应用提供了一种新的平台，通过阐释肼合酶的催化机理，有助于理解和利用厌氧氨氧化途径，降解人类活动引入环境的过量的氨氮。