五味子经ERK/P38-Nrf2通路调节内源性抗氧化基因与转运体及配伍环孢素A的减毒机制研究

In our previous studies supported by NSFC, we have found that Wu Wei Zi can regulate expression of antioxidant gene and transporter protein via Nrf2 pathway. However, the exact mechanism of this regulative effect is not completely understood. So we apply for further investigation on the mechanism of Wu Wei Zi activating Nrf2 signaling pathway. By the method of establishment and transfection of pEZ-M07-Keap1-C151S, pEZ-M07-HA-Nrf2 and pEZ-M07-Myc-Cul3 plasmids, The study will focus on Nrf2 ubiquitin level and the protein interactions between Keap1/Cul3-Nrf2 influenced by Wu Wei Zi treatment. we will also investigate the effect of ERK/P38 kinase on Nrf2 phosphorylation and determining the exact phosphorylation site by using different phosphorylation antibody. Based on above studies and clinical medicine practice, we propose to investigate the action target of Nrf2 signal pathway in Wu Wei Zi protecting liver and kidney from toxicity of CsA by use of pFIV-GFP-shNrf2 plasmid. Furthermore, we will try to illustrate the attenuation mechanism of compatibility combined with in vivo experiment. All of our study results are aimed to provide scientific basis for clinical medication. It can also lay a foundation to study attenuation of CsA through the new target of Nrf2 pathway.

前期我们在国家自然科学基金资助下，发现五味子可经Nrf2通路调控下游抗氧化基因与转运体的表达，但对其机制尚不清楚。本项目申请进一步研究五味子激活Nrf2信号通路的机制，重点是构建搭载Keap1 Cys151突变体的pEZ-M07-Keap1-C151S、HA标签的pEZ-M07-HA-Nrf2及pEZ-M07-Myc-Cul3质粒，研究五味子对Nrf2泛素化及Keap1/Cul3-Nrf2蛋白质间相互作用的影响；利用不同磷酸化抗体考察ERK/P38激酶对Nrf2磷酸化的影响，并确定作用位点，阐明其在五味子激活Nrf2信号通路中的交互作用。在此基础上，立足临床用药实践，通过构建pFIV-GFP-shNrf2质粒确定Nrf2信号通路在五味子保护环孢素A肝肾毒性中的靶点作用；结合体内实验，阐明二药配伍减毒机制，为临床用药提供科学依据，并为建立以Nrf2通路为新靶点防治环孢素A毒性的研究奠定基础。

环孢素A(cyclosporine A，CsA)目前仍是器官移植后免疫抑制和抗排斥反应的首选药物，但它的肝肾毒性极大限制了其临床应用。如何在维持CsA 免疫治疗的同时降低其肝肾毒性成为移植领域亟待解决的关键问题。本项目从五味子激活Keap1-Nrf2-ARE 信号通路的分子机制出发，立足于临床CsA 与五味子联合应用实践，确定Nrf2 信号通路在五味子保护CsA 肝肾毒性中的靶点作用；并阐明二药联合应用的配伍减毒机制，为临床用药提供科学依据。.本项目研究结果表明，（1）五味子醇提物（SCE）通过诱导ARE-luc报告基因的活性激活Nrf2信号通路，并通过Nrf2信号通路诱导HepG2细胞内HO-1、MRP2及P-gp等II相代谢酶、GSH、GST等内源性抗氧化酶及转运体的表达，其激活Nrf2信号通路可能与其上游ERK、p38MAPK激酶通路的调控作用有关。（2）五味子多糖SCP-2促进胞浆中Nrf2与Keap l的解离，抑制胞浆内Keap 1的表达，促进Nrf2向核内转移；并延长Nrf2的半衰期，増强Nrf2的DNA结合能力。（3）构建了Nrf2干扰稳转细胞株和含有双荧光素酶ARE报告基因载体PGL-ARE-Luc2P及pRL-TK的质粒。（4）SCE对CsA引发的肾毒性具有保护作用，其保护CsA肾毒性与抗氧化应激、调节凋亡、自噬和促进药物外排等机制有关。SchB 对CsA 致HK-2 细胞毒性具有保护作用，其保护机制为抗凋亡和自噬作用。（5）通过代谢组学技术鉴定CsA大鼠肝肾毒性发生的潜在生物标志物及SCE的拮抗作用；SCE对大鼠CsA诱导肝肾毒性的保护作用机制可能是激活Nrf2信号通路调控机体氧化应激和抑制组织细胞凋亡的发生来实现。.以上表明，五味子通过诱导ARE-luc报告基因的活性激活Nrf2信号通路，并通过Nrf2信号通路诱导内源性抗氧化酶及转运体的表达，増强Nrf2的DNA结合能力；其对CsA引发的肝肾毒性具有保护作用，与激活Nrf2信号通路调控机体抗氧化应激、调节凋亡、自噬和促进药物外排等机制有关；阐明了五味子与CsA配伍应用的机制，指导两药临床联合用药。