磁性超声靶向微泡介导CPT1A-shRNA转染治疗乳腺癌的实验研究

Breast cancer has become the leading cause of death in female. Currently targeted therapy for breast cancer (e.g.,herceptin) has exhibited drug resistance and side effects such as cardiac toxicity, making it necessary to find a novel, safer and more efficient therapy. Studies have shown that CPT1A is highly expressed in breast cancer and takes an active role in promoting the proliferation and metastasis of tumor cells via a variety of mechanisms. Thus, CPT1A offers an ideal target for gene therapy of breast cancer.This study is aimed to assemble iRGD peptide, which has a high affinity with Integrin alpha v beta 3 (Integrin αvβ3), and magnetic particles to the surface of self-made lipid microbubbles in order to build a kind of magnetically-guided ultrasound microbubbles to target breast cancer cells. These microbubbles willl be used to carry plasmids of CPT1A short hairpin RNA interference (CPT1A - shRNA), and a magnetic navigation technique will then be applied to counteract the high shear stress of blood flow in arteries to ensure an efficient binding of microbubbles with targeted molecules on tumor vascular endothelial cells. A high power ultrasound will be then used to break microbulles to release therapeutic genes into breast cancer cells. Through CPT1A-shRNA transfection，the CPT1A gene in cancer cells will be silenced, leading to inhibited cell apoptosis and proliferation. This researh program will provide a new avenue to a safer and more effcicient therapy of breast cancer.

乳腺癌已成为女性疾病致死的首要病因。目前乳腺癌的靶向治疗(如赫赛汀)存在耐药性及心毒性等副作用。因此有必要寻求一种新的更为高效、安全的治疗手段。研究表明，CPT1A在乳腺癌中存在异常高表达，通过多种机制促进了肿瘤细胞的增殖及转移，可以作为乳腺癌基因治疗的理想靶点。本研究试图将与整合素αvβ3（Integrin αvβ3）具有高亲和力的iRGD肽及磁性颗粒装配至自制脂质微泡表面，构建一种可靶向乳腺癌细胞的磁性导航超声微泡，借用此微泡运载CPT1A的短发卡状RNA干扰质粒（CPT1A-shRNA），利用磁场导航技术对抗体内动脉系统的高剪切应力，实现靶向微泡与肿瘤血管内皮细胞上靶分子的有效结合，并利用高强度超声破坏微泡，将治疗基因靶向传送至乳腺癌细胞内，通过基因转染实现乳腺癌细胞的CPT1A基因沉默、凋亡诱导及增殖抑制，为乳腺癌基因治疗提供一种更为安全和高效的新思路。

乳腺癌已成为女性疾病致死的首要病因，早诊断早治疗至关重要。因此本研究选择在乳腺癌中异常高表达的CPT1A为靶点，将与整合素αvβ3具有高亲和力的iRGD肽及磁性颗粒装配至自制脂质微泡表面，构建了一种可靶向乳腺癌细胞的磁性导航超声微泡，借用此微泡靶向运载CPT1A的短发卡状RNA干扰质粒（CPT1A-shRNA），并利用高强度超声破坏微泡，将治疗基因靶向传送至乳腺癌细胞内，实现乳腺癌的治疗。本研究首先使用薄膜水化法，制备了生物素化iRGD靶向磁性阳离子微泡。接着利用静电作用携载CPT1-shRNA质粒在微泡表面。然后利用生物素-亲和素桥接法将亲和素包被的Fe3O4连接到微泡表面，制备得到目标靶向磁性微泡。通过标记iRGD和磁性纳米颗粒，可以证实其成功连接在微泡表面，并测试了携载CPT1A-shRNA靶向磁性微泡的粒径，表面电位，稳定性和磁响应性。培养人乳腺癌MCF-7细胞，将其分为携载CPT1A-shRNA的空白微泡、靶向非磁微泡、非靶向磁性微泡和靶向磁性微泡组。不同微泡分别经微量注射泵以不同剪切应力(6-48 dyn/cm2)通过平行板流动腔2.5min,然后移除磁场，维持原来的流速冲1min，经倒置荧光显微镜拍照，即使是在最高的剪切力作用下，乳腺癌细胞对靶向磁性微泡的摄取都要远远高于其他组。将MCF-7细胞与四组微泡-质粒复合物在磁场作用下孵育5min，在优化的超声和微泡作用下（2.4*106个/mL微泡浓度，1.0w/cm2超声辐照作用20s,20%占空比（on2s，off8s）），携载质粒的目标微泡具有最高的转染率，可达到20%。在体内研究中，在雌性BALB/c裸鼠大腿处建立MCF-7皮下肿瘤模型，并在其附近放置磁铁，通过尾静脉注射四种微泡复合物，进行超声成像，体内分布成像和基因转染。在肿瘤部位施加磁场作用，目标微泡在肿瘤部位的超声造影强度和体内分布成像强度都高于其他组的微泡。转染后48小时进行冷冻切片，可以发现目标微泡复合物在肿瘤部位具有最高的转染率。通过超声定向破坏微泡实现基因转染为乳腺癌基因治疗提供一种更为安全和高效的新思路。