德氏乳杆菌保加利亚亚种重要生产特性及其相关基因的研究

Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus is one of the most common bacterial starter cultures in the production of fermented milks. Characteristics of the bacterial strains like protein degradation and lactose metabolism directly affect the quality of fermented dairy products. Different strains have different above mentioned characteristics. However, the genetic origin of these differences is still unknown. Thus, this project aims to reveal the mechanism giving rise to such phenotypic variation by analyzing more than 400 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus target strains previously isolated by our laboratory from various geographical locations. Based on our preliminary MLST and phenotype analyses, typical strains differing from their phenotypic and genotypic characteristics were selected. A combined approach of whole genome re-sequencing together with strain phenotype analysis will be applied for the first time in this study. In order to comprehensively and systematically elucidate the different capacities in protein degradation and lactose metabolism between different strains, comparative genomic analysis of their coding, non-coding and gene regulatory regions in the genomes, as well as other features like DNA methylation pattern, will be performed. Such analysis will reveal the mechanism and regulation of these metabolic features at the genomic level. This project will advance the research, development and utilization of lactic acid bacterial starter cultures of China, as well as lay a solid theoretical basis in this research field. Therefore, it serves as a significant and practical reference for the development of future work.

保加利亚乳杆菌是生产发酵乳最常用的发酵剂菌种之一，菌株的蛋白分解、乳糖代谢等生产特性将直接影响到发酵乳制品的品质。不同菌株有着不同的特性，但这些差异特性产生的起源目前还不得而知。本项目以实验室从不同地区分离的400余株保加利亚乳杆菌为研究对象，以前期MLST分析结果和表型特征为依据，选取典型的表型和基因型差异菌株，首次采用基因组重测序的方法，结合菌株表型特征，通过比较基因组分析具有不同生产特性菌株在基因组水平的差异，从编码区、非编码区、基因调控区以及DNA甲基化等多方面对不同分离株蛋白分解和乳糖代谢能力进行全面系统的研究，以期在基因组水平揭示其不同特性差异发生的机理机制，为我国乳酸菌发酵剂的进一步研究、开发和利用奠定理论基础，具有重要的实际生产意义。

本项目完成了188株德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）自然发酵乳分离株的全基因组测定，结合公共数据库已公布的12株分离株的基因组数据，构建了200株德氏乳杆菌保加利亚亚种分离株基因组数据集。基于群体基因组学和功能基因组学对该数据集进行了分析，共鉴定到44559个SNP位点，7271个InDels变异，构建了1087个基因的核心基因集和3436个基因的泛基因集。系统发育分析发现群体内可分为四个遗传谱系，具有较高的遗传多样性和重组异质性。不同地域的分离株进化历程存在明显差异，形成了具有明显地域聚集性特征的种群结构。结合25株不同谱系代表性菌株的凝乳时间、产酸速率等重要生产特征数据，利用全基因组关联分析定位到一个与产酸性能显著相关的非同义突变位点，该位点位于基因乳酸脱氢酶（Ldb2036，第133位密码子，由P突变为T），经过进一步验证发现该位点预测产酸速率的准确率可达80%以上。此外，采用PacBio SMRT三代测序技术完成了10株菌的全基因组测定和甲基化组学分析，鉴定到了m6A和m4C两种甲基化模式，识别了42种甲基化位点的motifs基序，构建了德氏乳杆菌保加利亚亚种的甲基化位点图谱，功能注释发现在D-乳酸脱氢酶（ldhD）等功能基因上存在甲基化位点。进一步使用绝对定量PCR（ddPCR）进行验证发现甲基化显著影响了ldhD的表达量。本研究从群体遗传学揭示了德氏乳杆菌保加利亚亚种群体具有较高的遗传多样性和重组异质性，使用全基因组管理分析定位到了一个与产酸速率显著相关的非同义突变位点（Ldb2036），基于甲基化组学探讨了DNA甲基化对菌株产酸速率的影响，为我国乳酸菌发酵剂的进一步研究、开发和利用奠定理论基础。