保加利亚乳杆菌蛋白酶的凝乳特性及其相关基因发掘研究

Lactobacillus bulgaricus is one of the dominate bacteria for yoghurt starter cultures. Its fermentation characteristics and metabolic mechanism have the close relationships with the quality and diversity of yoghurt products. In our previous study we found there are great different for L. bulgaricus to synthesis of proteinases and significantly effect on the coagulation of milk, rheological characteristics of fermented milk and texture and sensory characteristics. The protease produced L. bulgaricus with the excellent production performance were screened in our previous study and used as the objective strains. Genomics and enzymology were utilized to reveal diversity of the protease produced by L. bulgaricus affect on quality of fermented milk. Modern chromatography/spectroscopy, mass spectrometry and bioinformatics were also used to deeply study the diversity components of the protease. In addition, confocal microscopy, fluorescent staining technique, nanometer laser particle size analysis, gel permeation chromatography, RP-HPLC and LC/ESI/MS technique were implied to investigate the mechanism of the protease promote milk coagulation. Array-based comparative genomic hybridization techniques were also utilized to identify the key genes of promote milk coagulation protease component and the secretion and expression of protease under the acid stress were studied. The aim of this project is to provide the theoretical basis and foundation for producing high-quality, diversity kinds of yoghurt。

保加利亚乳杆菌是酸奶发酵剂的重要菌种之一，其特性及代谢产物与品质、品种多样化密切相关。前期研究表明，不同乳酸菌（或菌株）产蛋白酶的能力存在很大差异，对牛乳凝乳、发酵乳流变学特性、质地和感官性质有很大影响。本项目拟以前期筛选得到的生产性能优良、具有明显产蛋白酶能力的保加利亚乳杆菌为研究对象，从基因组学和酶学角度揭示保加利亚乳杆菌蛋白酶的多样性及对发酵乳品质的影响。通过现代色/光谱技术与和质谱技术及生物信息学手段深入研究保加利亚乳杆菌蛋白酶酶系构成的多态性；利用激光共聚焦技术、荧光染色技术、纳米激光粒度分析技术、凝胶渗透色谱技术、RP-HPLC和LC/ESI/MS技术，从多尺度、多层面探讨蛋白酶促进牛乳凝乳的作用机理；利用微阵列-比较基因组杂交技术发掘促凝乳蛋白酶组分关键基因，研究酸胁迫下该蛋白酶的分泌表达。本项目旨在为高品质、差异化发酵乳的社会需求提供理论依据和基础。

乳酸菌蛋白酶直接作用于乳中的酪蛋白，对发酵乳制品风味和质地的形成以及品质具有重要的影响。本项目以实验室分离的保加利亚乳杆菌菌株为研究对象，确定了具有促进凝乳质量蛋白酶菌株，研究了其蛋白酶性质及其对凝乳理化性质和凝块品质的影响，揭示了保加利亚乳杆菌蛋白酶促凝乳机制，并对保加利亚乳杆菌促凝乳蛋白酶基因及其酸胁迫表达进行了探索研究，为高品质发酵乳的生产提供了理论依据和基础。通过对发酵乳质构分析，结合对筛选菌株的蛋白水解力和蛋白酶活力，筛选出3株对乳凝胶质量促进作用最显著的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株CH9-3 4.0、SH3 4.3和SB5。在此基础上，对乳酸菌蛋白酶进行了分离纯化，确定了最适合乳酸菌蛋白酶提取纯化的方法和条件，得到了电泳纯的保加利亚乳杆菌CH9-3 4.0、SH3 4.3和SB5蛋白酶，其分子量分别为39、40和52 kDa，得率分别为46.6%、39.3%和40.4%。酶学性质研究表明这3株乳酸菌纯化蛋白酶的最适反应温度均为42℃，在4~50℃稳定；最适反应pH均为6.0，在pH 5.5~7.0稳定；Ba2+、Zn2+、Mn2+、Sn2+、Fe3+、EDTA和PMSF子明显抑制蛋白酶活力，Fe2+离子显著增加蛋白酶活力。研究了其对发酵乳凝胶质量的影响机制，结果证实乳酸菌蛋白酶可以显著提高发酵乳凝胶的凝胶硬度、稠度、表观黏度、粒径；显著降低发酵乳凝胶样品蛋白质表面负电荷，促进表面电荷达到静电平衡；蛋白酶的水解作用显著增加游离Ca2+含量，减少凝胶结构中酪蛋白结合的Ca2+含量，增加样品凝胶的黏度、剪切应力、凝胶结构强度和弹性模量。确定了保加利亚乳杆菌促凝乳蛋白酶关键基因prtB及其表达影响因素，初始pH对保加利亚乳杆菌促凝乳蛋白酶基因有明显影响，但是基因表达受到菌株自身的影响，在不同菌株之问呈现一定差异，保加利亚乳杆菌促凝乳蛋白酶基因prtB的表达水平随初始pH的上升总体呈现上调趋势。pH值通过对菌株自溶影响进而影响蛋白酶的分泌表达，实时荧光定量PCＲ分析表明保加利亚乳杆菌关键蛋白酶基因prtB的表达量呈pH依赖性，且菌株间各蛋白酶基因表达量有较大差异。