德氏乳杆菌保加利亚菌株CH3双组分系统HPK/RR1耐酸调控基因鉴定

The acid tolerance ability is a key factor to evaluate properties of the probiotic strains and to influence the cell density of dairy starter cultures. Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus is one of the most commercially important of all lactic acid bacteria, and widely used in yogurt production. Recent studies from our lab indicated that two-component system HPK1/RR1 was involved in the regulation of acid tolerance and growth rate in L. delbrueckii subsp. bulgaricus CH3, which was isolated from yogurt in traditional pasturing area, Inner Mongolia, China. And there was an information interaction between histidine protein kinase HPK1 and response regulator protein RR1 by the transfer of the phosphate group. Therefore we speculated that the phosphorylated response regulator protein RR1 served as a transcription factor and regulated the acid tolerance ability of bacteria by activating or inhibiting other genes expression. The aim of this study is to identify genes activated by HPK1/RR1 by means of cDNA-AFLP, construct the acid tolerance regulatory network, and clarify the acid tolerance regulation mechanism, offer a foundation for improvement of the cell density of dairy starter cultures. The study is as following: to analyze strains CH3, HPK1 mutant and RR1 mutant by means of cDNA-AFLP and real-time PCR technology, and get differentially expressed genes; to construct key genes mutants and determine functions of key genes in the regulation of acid tolerance; to reveal the activate activity of HPK1/RR1 on key genes, and to construct a network of acid tolerance regulation by HPK1/RR1.

耐酸能力是衡量益生菌性能的关键指标，也是制约乳品发酵剂菌体密度的关键因素。德氏乳杆菌保加利亚亚种是最具经济价值的乳酸菌之一，广泛用于酸奶生产。本课题组最新研究发现双组分系统HPK1/RR1参与该菌CH3菌株的耐酸能力和生长速率的调控，且HPK1与RR1间存在磷酸基团传递。因此推测磷酸化的RR1作为转录因子激活或抑制其他基因的表达，进而调控该菌耐酸能力。本研究拟利用cDNA-AFLP技术确定被该双组分系统调控的基因，旨在揭示相应蛋白，建立耐酸调控信号网络，明确该菌耐酸调控机制，进而为提高乳品发酵剂菌体密度提供理论依据。本研究包括三部分：首先以cDNA-AFLP和实时定量PCR技术分析野生型CH3、HPK1及RR1突变株，初步筛选差异基因；接着构建关键差异基因突变体，研究其在该菌耐酸能力调控中的作用；确定HPK1与RR1对关键基因的转录激活活性，最终建立由HPK1/RR1所调控的耐酸调控网络。

德氏乳杆菌保加利亚亚种是最具经济价值的乳酸菌之一，广泛用于酸奶生产。耐酸能力是衡量益生菌性能的关键指标。本课题组以中国牧区传统发酵乳中分离获得的德氏乳杆菌保加利亚亚种优良菌株CH3为试验材料，以双组分系统HPK1/RR1为研究对象，对该双组分系统与该菌耐酸机制关系进行探讨，旨在建立耐酸调控信号网络，明确该菌耐酸调控机制，进而为提高乳品发酵剂菌体密度提供理论依据。本研究包括三部分：首先分析CH3、HPK1及RR1突变株，在正常发酵条件和酸诱导条件下，基因表达情况，初步筛选差异基因；接着构建关键差异基因突变体，研究其在该菌耐酸能力调控中的作用；确定HPK1与RR1对关键基因的转录激活活性，最终建立由HPK1/RR1所调控的耐酸调控网络。研究表明双组分系统HPK1/RR1突变后，影响多个代谢途径。（1）在自然发酵条件下，HPK1突变后，有22个蛋白表达量发生明显变化，包括碳水化合物代谢相关蛋白9个、转录和翻译过程相关蛋白6个、多肽转运和降解过程相关蛋白3个、细胞形态相关蛋白2个、压力反应过程相关蛋白1个，核苷酸代谢和DNA损伤修复过程相关蛋白1个。RR1突变后，有17个蛋白表达量发生明显变化，包括核苷酸代谢和DNA损伤修复过程相关蛋白5个、转录和翻译过程的相关蛋白9个，H+转运ATP酶/ATP合成酶α亚基、LacZ、Ldb0147。（2）酸诱导条件下，HPK1突变后，有6个蛋白表达量发生明显变化，包括碳水化合物代谢相关蛋白2个、转录与翻译过程的相关蛋白1个、压力反应的相关蛋白1个、多肽转运和降解过程相关蛋白1个、细胞形态相关蛋白1个；RR1突变后，有16个蛋白表达量发生明显变化，包括碳水化合物代谢相关蛋白4个、转录与翻译过程相关蛋白4个、核苷酸代谢和DNA损伤修复过程的相关蛋白2个、多肽转运和降解过程相关蛋白1个、细胞形态相关蛋白3个、LacZ和LBUL_0961。以上结果表明，双组分系统HPK1/RR1通过质子泵相关蛋白、压力蛋白、碳水化合物代谢、核苷酸合成途径、DNA修饰、肽运输和降解途径、细胞壁合成途径等多种代谢途径，调控该菌的耐酸能力和生长能力。