复方苦芩防治犬细小病毒病的作用机理研究

复方苦芩由苦参、黄芩等药物组成，具有清热解毒，扶正驱邪的功能。犬细小病毒病是由犬细小病毒(Canine parvovirus，CPV)引起的，多发于幼犬的高致死性传染病，在肠道内，细小病毒的复制可杀死肠腺胚上皮细胞，引起肠上皮脱落、绒毛变短、呕吐和腹泻，免疫功能降低。中兽医辩证其属湿热毒邪所致湿热泻痢，宜清热解毒，扶正祛邪。前期研究表明，该方防治犬细小病毒病具有较好的作用，为了深入研究复方苦芩抗犬细小病毒的作用机理，我们拟通过活性导向分离法分离复方苦芩有效活性成分，寻找具有抗病毒作用的中药复方活性成分或先导化合物，并从细胞、分子生物学水平设计复方苦芩及有效活性成分对细小病毒病犬免疫功能的影响、复方苦芩及有效活性成分抗病毒效果、保护肠粘膜、促进肠再生的作用等试验，探索其作用的物质基础和在免疫增强功能、抑制病毒、保护肠粘膜、促进肠再生等途径的抗犬细小病毒病的作用机理，为其开发利用提供理论基础。

犬细小病毒病，是由犬细小病毒（Canine parvovirus，以下简称CPV)感染犬只而引起的一种常见的具有高度接触性传染病的疾病。复方苦芩具有清热燥湿止痢等功效。本研究探讨复方苦芩及其有效活性成分对细小病毒犬的作用效果及机制。第一，采用活性导向分离法筛选了复方苦芩中抗病毒活性成分，结果：复方苦芩含总黄酮6.61%，复方苦芩总多糖为52.6%，还含有生物碱等。第二，检测细小病毒病犬血清溶血素、NO/NO酶、碳粒廓清、T、B淋巴细胞转化、细胞因子，IL-2、IFN-γmRNA表达、血清抗体滴度，T淋巴细胞亚群，肠粘膜免疫指标（IgA）等。结果，复方苦芩及其有效活性成分能有效地提高小鼠碳粒廓清指数，小鼠血清溶血素；降低犬血清NOS活性、NO含量以及IL-4含量的增加，提高犬血清CPV抗体效价和IFN-γ含量；调节T淋巴细胞亚群和肠粘膜免疫指标（IgA）；降低IL-4 mRNA表达，提高IFN-γ mRNA表达。表明，复方苦芩及其有效活性成分能提高细小病毒病犬免疫功能，其中有效活性成分中复方苦芩总多糖效果最优。第三，测定复方苦芩及有效活性成分对F81细胞的最大安全浓度；测定各成分对CPV的直接作用；对病毒的阻滞作用；对CPV吸附细胞的抑制作用；对CPV穿入的抑制作用；对CPV复制的抑制作用；各中药成分抗CPV的效果；结果表明，复方苦芩及其有效活性成分能降低IL-4mRNA的表达，提高IFN-γmRNA的表达，能在感染病毒初期时增强犬的非特异性免疫功能、促进机体分泌IgG、IgM、IL-2、IL-4及IFN-γ等抗体和细胞因子、促进外周血CD3+CD4+T淋巴细胞及犬脾脏T、B淋巴细胞的增殖。第四，通过光学显微镜和电子显微镜观察肠壁组织学结构，PCR检测凋亡基因mRNA表达和免疫组化观察观察复方苦芩及有效活性成分对细胞凋亡的影响等试验，结果显示，复方苦芩及有效活性成分能促进犬小肠组织的恢复，降低犬小肠组织中细胞的凋亡率，降低细小病毒病引起的caspase-3 mRNA转录的增加，调节Bcl-2和Bax mRNA转录，升高Bcl-2/Bax比值，调节Bcl-2和Bax蛋白表达，升高Bcl-2/Bax蛋白比值。提示，活性导向分离法可分离复方苦芩有效活性成分，该方有增强免疫功能、抑制病毒、保护肠粘膜、对研究复方中药及其有效活性作用与物质基础的关系建立了基础，意义重大。