Prx2基因在MEHP致精母细胞氧化损伤过程中的功能及其分子机制研究

Mono-(2-ethylhexyl) Phthalate (MEHP) can induce oxidative stress in testis through the overproduction of ROS, which could lead to the damage and apoptosis of spermatogenic cells. The results of our previous study showed that the expression of Prx2 was significantly up-regulated in vasectomized testis, subsequently ameliorating testicular damage towards control level, which implied the important role of Prx2 in protecting spermatogenic cells from oxidative damage. However, there were still the following problems need to be studied: (1) the function and molecular mechanism of intracellular Prx2 gene in spermatogenic cells damage caused by oxidative stress, (2) the subcellular localization of Prx2 when spermatogenic cells oxidative injury. Based on our previous work, we will reveal the protection mechanism of Prx2 on mouse spermatocyte-derived cell line damage induced by MEHP from the above two points in the present study. This project will provide new ideas and drug targets for the prevention and cure the damage of male reproductive function induced by phthalate esters.

邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯（MEHP）可通过过量活性氧簇（ROS）的产生诱导睾丸发生氧化应激，造成生精细胞损伤和凋亡。申请者前期研究发现抗氧化蛋白Prx2在输精管结扎后的小鼠睾丸中表达显著上调，缓解了睾丸的氧化损伤，这预示着其在保护生精细胞方面的重要作用。但仍有以下问题需要研究：（1）细胞内的Prx2基因在生精细胞氧化损伤过程中的功能及分子机制；（2）生精细胞损伤时Prx2是否会发生移位。本课题拟在前期工作的基础上，以上述两点为切入点，揭示细胞内Prx2对MEHP致小鼠精母细胞氧化损伤的保护机制。通过本项目研究可为防治邻苯二甲酸酯类造成的男性生殖功能损伤提供新的思路和靶点。

邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯（MEHP）可通过过量活性氧簇（ROS）的产生诱导睾丸发生氧化应激，造成生精细胞损伤和凋亡。Prx2是一新近发现的在睾丸及精子抗氧化防御方面发挥重要作用的抗氧化蛋白，而目前关于Prx2应激应答机制及其在精子中抗氧化保护应用还知之甚少。.本项目主要完成了以下工作：.1. 成功构建高效率的Prx2基因的RNAi及过表达载体。.2. 小鼠精母细胞MEHP处理前后，Prx2的亚细胞定位无改变。.3. 正常精母细胞经MEHP处理后，细胞内Prx2、Prx3、Prx6及CAT等基因mRNA表达代偿性显著升高。与正常精母细胞相比，干扰Prx2后，细胞内的Prx6表达代偿性显著上调，而其他抗氧化剂表达无显著变化。.4. 与正常精母细胞经MEHP处理相比，干扰Prx2基因的细胞经MEHP处理12h，24h后，细胞增殖能力显著降低，细胞内ROS水平及凋亡细胞百分比显著升高，而过表达拯救实验显著提高细胞增殖能力，并显著降低细胞内ROS水平及凋亡细胞比例。这表明Prx2在精母细胞抗氧化损伤方面发挥重要作用。.5. 从4个经典的凋亡途径切入，探讨Prx2在MEHP诱发精母细胞凋亡过程中参与调控的信号通路，发现Prx2基因是通过线粒体介导及内质网应激介导的途径来调控MEHP诱发的精母细胞凋亡。.6. PRDX2蛋白在临床弱精症患者精浆和精子上表达水平低于正常人。成功表达并纯化TAT-PRDX2融合蛋白，且其能够顺利进入精子。更为有意义的是，TAT-PRDX2能够显著提高弱精症患者精子的前向运动能力，且精子DNA损伤程度得到了明显改善。这将为临床弱精子症的预防及治疗提供新思路。.7. 从冷冻复苏后精子质量及功能入手，综合评价TAT-PRDX2蛋白在正常及低质量精液冷冻保存中的临床应用价值。发现精子冷冻保护液中添加该蛋白能够通过降低精子内ROS水平，有效改善精子质量（运动、存活率、DNA损伤等）及功能（顶体反应），尤其对于弱精子症精液样本。这为研制新型高效精液冷冻保护剂提供一有潜力添加物。