雌激素对心肌L型钙通道调控的信号转导机制

本研究旨在研究雌激素调控心脏L型钙通道的信号转导机制。在长QT综合征患者中，女性更易发生致死性的尖端扭转性室性心动过速。雌激素在其中起了重要作用。我们前期研究已经发现雌激素增加了心肌细胞ICa-L，上调了Cav1.2α的表达。雌激素还降低了ICa-L对β-肾上腺素受体的反应性。更重要的是，雌激素促进了药物诱发的心律失常。但是雌激素调控L型钙通道的机制尚不清楚。本研究拟鉴别介导雌激素调控L型钙通道作用的受体亚型，在转录水平及翻译后水平探索雌激素调控L型钙通道的信号转导机制。采用原代培养的心肌细胞，RNAi技术沉默特定亚型雌激素受体、全细胞膜片钳技术测定ICa-L、定量RT-PCR和激光共聚焦显微镜测定Cav1.2α表达水平。本研究不仅有助于揭示TdP易感性性别差异的机制，而且加深了离子通道调控机制的认识，为改善心律失常的治疗奠定基础。

L型钙通道（Ca-L）在心肌细胞动作电位平台期的形成和维持以及心肌细胞兴奋-收缩耦联中发挥重要作用。其功能改变是影响早后除极及尖端扭转性室性心动过速（TdP）的重要因素。已有研究显示，雌激素（E2）是影响TdP易感性的重要因素。本研究旨在进一步探究雌激素调控Ca-L的作用及信号转导机制。在大鼠心肌细胞系H9C2细胞和原代培养的心室肌细胞中，采用膜片钳技术测定ICa-L、westernbolt方法测定Cav1.2α表达水平，ELISA方法分析转录因子活性以及圈套寡核苷酸技术进一步确定转录因子的作用。结果：1）E2浓度依赖性显著增加家兔心肌细胞ICa-L，但并未改变ICa-L I-V曲线的形状。E2可受体依赖性的上调ICa-L，主要由ERα介导。E2明显增加Cav1.2α 的mRNA和蛋白表达水平。E2与转录抑制剂放线菌素D和翻译抑制剂放线菌酮共同孵育后其上调ICa-L的作用被抑制。2）在大鼠心室肌细胞系H9C2细胞和原代大鼠心肌细胞中，E2孵育也可浓度依赖性的增加ICa-L和Cav1.2α的蛋白表达；E2与BSA（E2-BSA）结合后仍可与产生与E2同等的上调Cav1.2α表达的作用；雌激素受体抑制剂ICI 182,780可阻断E2上调Cav1.2α蛋白表达的作用。3）对转录因子活性的研究显示，E2孵育30 min内可显著增加p-CREB的表达，但随着时间的延长，p-CREB的活性表达有所下降；E2可显著抑制转录因子NF-κB的活性；E2可显著增加ERα和ERβ的活性，但E2-BSA对ERα和ERβ的活性无明显影响。4）PI3K抑制剂LY294002可抑制E2上调Cav1.2α蛋白表达的作用；而MAPK抑制剂U0126及PKA抑制剂 KT5720无明显影响； LY294002和KT5720均可显著抑制E2上调家兔心肌细胞ICa-L的作用，而U0126无明显影响。5）LY294002可显著抑制E2引起的p-CREB表达升高。6）转染CREB圈套寡核苷酸可显著抑制E2上调Cav1.2α蛋白表达的作用。本研究结果提示快速，核外雌激素受体信号通路在雌激素转录调控心肌Ca-L功能中发挥了重要作用，雌激素可通过膜雌激素受体/PI3K/CREB通路上调Ca-L的功能。本研究识别了快速雌激素受体信号通路在Ca-L调控中的作用，可能为解释心律失常的性别差异及个体化治疗提供理论基础。