新城疫DNA疫苗三甲基壳聚糖纳米粒黏膜免疫传递系统的构建及其免疫作用机制研究

可生物降解纳米粒具有在胃肠道内保护药物不被降解、提高药物的跨膜转运及M细胞的胞吞作用、缓控释等优点，使其成为了黏膜免疫递送系统的优良载体。三甲基壳聚糖TMC与壳聚糖相比，具有良好的水溶性，在碱性条件下仍带有高密度的正电荷，有更好的促吸收作用。本研究以制备的TMC为载体，采用离子交联法制备载新城疫DNA疫苗纳米粒，通过考察纳米粒的形成条件、红外光谱和表面形态及高分子基材浓度等对纳米粒粒径、粒径分布和表面电位的影响及动物实验免疫效果评价，建立疫苗纳米化的安全级黏膜免疫传递系统；同时，对制备的载疫苗纳米粒诱导的免疫反应程度及其与肠上皮细胞相互作用机制进行探讨。本研究将实现疫苗在体内的长效作用机制，增强免疫效果，增加给药途径、诱导黏膜免疫的目的；本课题也将提高动物疫苗的黏膜免疫应答水平，并带动物疫苗的产业技术进步及产品更新换代，对解决和推动疫苗黏膜免疫研究以及靶向释放等关键技术具有重要的战略意义。

本项目按计划任务书约定的任务、考核目标及预期成果，已完成了计划任务。合成了N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖和N, O-羧甲基壳聚糖，并对壳聚糖、N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖、N, O-羧甲基壳聚糖的傅里叶红外光谱（FTIR）及1H NMR和13C NMR等进行了分析。分别以壳聚糖、N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N, O-羧甲基壳聚糖为载体，构建了新城疫DNA疫苗壳聚糖纳米粒、新城疫DNA疫苗N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N, O-羧甲基壳聚糖纳米粒和新城疫La Sota弱毒苗N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒黏膜免疫递送系统，并对构建的纳米粒黏膜免疫传递系统的安全性和免疫效果进行了评价。试验结果表明，构建的纳米粒黏膜免疫递送系统安全性好，免疫后可刺激机体产生较强的细胞免疫、体液免疫和黏膜免疫，与新城疫裸DNA疫苗、新城疫La Sota弱毒苗和新城疫La Sota油乳剂灭活疫苗相比均有显著差异（p＜0.05），显著提高了免疫效果，起到了缓释作用。. 此外，本项目以壳聚糖为载体，以新城疫La Sota病毒液为模型药物，采用离子交联法制备新城疫La Sota系活疫苗壳聚糖纳米粒（NDV-CS-NPs）。试验结果表明，NDV-CS-NPs黏膜免疫递送系统具有较高的安全性，用NDV-CS-NPs免疫后可刺激机体产生较强的体液免疫和细胞免疫，与新城疫La Sota弱毒苗和新城疫La Sota油乳剂灭活疫苗相比均有显著差异（p＜0.05），且纳米疫苗免疫组对强毒株的攻毒产生了较好的保护，保护效力优于新城疫新城疫La Sota弱毒苗和油乳剂灭活苗。. 本项目已发表学术论文12篇，其中SCI论文6篇、EI论文3篇；申请国家发明专利7项，已获授权5项；获黑龙江省科学技术奖（自然科学）二等奖1项、黑龙江省畜牧科技奖（自学科学）一等奖1项、哈尔滨市科学技术奖二等奖1项，黑龙江省自然科学技术学术成果奖一等奖1项；同时，项目主持人还获得了第十一届黑龙江省青年科技奖。培养了9名硕士研究生完成毕业论文。本项目研究实现了疫苗在体内的长效作用机制，增强了免疫效果，诱导了黏膜免疫的目的；同时，本项目对解决和推动疫苗黏膜免疫研究以及靶向释放等关键技术提供了可借鉴的研究思路和方法。