内生真菌紫杉醇生物合成调控基因的筛选和功能分析

在国家自然科学基金（30570025，已结题）和相关项目资助下，获得了高产紫杉醇菌株HDF-68（已申请国家发明专利），构建出了该菌株紫杉醇合成期消减非合成期的cDNA文库，筛选出了一批与紫杉醇合成相关的候选基因ESTs，有2条与紫杉醇合成有直接或密切相关；建立了针对该菌株的ATMT高效遗传转化体系。本项目以HDF-68为出发菌株，拟利用ATMT法对已获得的相关侯选基因进行打靶，进而根据转化子产紫杉醇量的变化来确定该侯选基因是否为HDF-68合成紫杉醇的调控基因；采用ATMT法转化HDF-68，获得转化子库，筛选紫杉醇产量发生变化的突变子，进而利用TAIL-PCR分离HDF-68合成紫杉醇的调控基因；最后，采用RACE获取HDF-68合成紫杉醇调控基因的全长，并在核酸和蛋白水平对其进行功能分析。该项目研究将为阐明微生物合成紫杉醇的代谢途径提供理论依据，为构建高产紫杉醇基因工程菌株奠定基础。

按计划任务书约定的任务、考核目标及预期成果，本项目已完成了计划任务。.在本项目资助下，在本项目资助下，构建了高产紫杉醇菌株与出发菌株差异表达的cDNA消减文库、紫杉醇产生菌紫杉醇合成期消减非合成期的cDNA文库和高比例全长cDNA文库，建立了紫杉醇产生菌的ATMT高效的遗传转化体系，筛选到了紫杉醇产量发生变化的突变子，并分离到了6个内生真菌紫杉醇生物合成调控基因，分别为紫杉二烯-5α-羟化酶基因、GGPP合成酶基因、紫杉烷-10β-羟化酶基因、紫杉二烯-5α-醇-乙酰基转运酶基因、紫杉烷-2α-羟化酶、紫杉烷-13α-羟化酶。发表了7篇与本项目相关的学术论文，其中SCI收录2篇，国家级刊物3篇；在中国科学技术出版社出版学术专著1部；申请国家发明专利4项，已获授权2项；获黑龙江省科学技术奖（自然科学）二等奖1项、哈尔滨市自然科学技术学术成果奖三等奖1项、黑龙江大学优秀科研成果奖三等奖1项。培养了6名硕士研究生完成了毕业论文。.另外，还获得了特异性的抗紫杉醇单克隆抗体并建立了间接ELISA检测方法，为从内生真菌生物合成紫杉醇发酵液中迅速、高效地分离纯化和检测紫杉醇奠定了基础；同时，在高产紫杉醇基因工程菌株的构建方面也取得了一定的进展，已成功构建了高产紫杉醇菌株HDFS4-26（紫杉醇产量为516.37μg/L，授权号：ZL 200810064048.3）的表达载体，为采用基因过量表达手段将筛选到的6个内生真菌紫杉醇生物合成过程中的酶基因导入菌株HDFS4-26，构建高产紫杉醇基因工程菌株奠定了基础。