细胞膜色谱法高通量筛选抗菌肽及在食品中的应用研究

Antimicrobial peptides (AMPs) with high level antimicrobial activity, broad-spectrum and less drug-resistant, have broad application prospects in the field of food preservatives, pharmaceuticals and bio-feed additive. However, the limited resources of natural AMPs, the complexity of the extraction process, the cost of chemical synthesis and the difficulty of gene expression, limit the large scale product of AMPs and become the bottleneck of the development and application of AMPs. Consequently, to study how to high-throughput screen and to prepare of AMPs from natural raw materials, improving the efficiency of production of AMPs, is the key step for the development and application of AMPs. Based on the membrane-binding activity of AMPs, a novel method named cell membrane affinity chromatography was firstly developed to isolate AMPs. Different bacterial cell membrane stationary phase, column preparation and properties, chromatographic behaviors of AMPs in the CMC model will be studied deeply. The suitable CMC model for high-throughput screening and isolation of AMPs will be established. Furthermore, this model will be applied to screening and separation of AMPs from different food materials and the antibacterial law in different food systems will be investigated, which will provide a theoretical basis and technical support for rapid, targeted screening the kind of AMPs food preservatives. The project does not only make the high-throughput screening and preparation of AMPs possible, but also can target to screen the kind of AMPs food preservatives applied for different foods.

抗菌肽是一类生物活性肽，具有抗菌活性高、抗菌谱广、不易产生耐药性等特点，在天然食品防腐剂、医药、生物饲料添加剂等方面有着广阔的应用前景。目前天然抗菌肽资源有限且提取工艺复杂，化学合成成本昂贵及基因表达困难，使得抗菌肽难以规模化生产，这已成为抗菌肽开发应用的瓶颈。如何提高抗菌肽的生产效率是抗菌肽开发和应用的关键。本项目从抗菌肽的膜结合作用机理入手，首次尝试将细胞膜色谱法（CMC）应用于抗菌肽的筛选，通过系统研究不同菌体的细胞膜固定相、色谱柱的制备、特性及抗菌肽在CMC模型上的色谱行为特征，建立适合抗菌肽筛选分离的CMC模型。并应用该模型从不同食品原料中筛选和分离其中的抗菌肽，研究其在不同食品体系中的抗菌规律，为快速、定向筛选出肽类食品防腐剂提供理论依据和技术支持。项目研究不仅使高通量地筛选、制备抗菌肽成为可能，而且还能有针对性地筛选应用于不同食品的肽类防腐剂，具有十分重要的意义。

抗菌肽具有不同于传统抗生素的抗菌机制，可有效解决细菌耐药性难题，在医药、食品、饲料加工等领域具有广阔的应用前景。天然抗菌肽来源有限，且传统分离纯化步骤繁琐、分离效率低、产量低，极大限制了其规模化生产和应用。因此，建立新型、高效、靶向性强的筛选方法，已成为相关研究的焦点。研究证实抗菌肽发挥其抑菌作用的首要步骤是与细菌细胞膜相互作用，大部分抗菌肽都具有膜亲和特性。离体条件下组装模拟细胞膜已被用于研究抗菌肽的膜作用机制，但尚未见以此为亲和媒介筛选抗菌肽的研究。本项目基于抗菌肽与模拟细胞膜的亲和作用，将模拟细胞膜、固相萃取、高效液相色谱和平衡透析技术结合，构建多种新型抗菌肽筛选分离方法，并进行了实际应用研究。研究内容包括：利用磷脂模拟细胞膜固相萃取联合HPLC技术成功从卵白蛋白胃蛋白酶水解产物中分离得到Opep12；用大肠杆菌模拟细胞膜色谱从麻风树粕及其水解物、鳀鱼粗肽中制备了3种抗菌肽分别为JCpep7、JCpep8和Apep10；采用金黄色葡萄球菌脂质构建平衡透析体系，应用于鳀鱼蒸煮液蛋白水解物中抗菌肽的筛选，所得抗菌肽为将其命名为ACWpep10；反复冻融及超声波协同作用破碎酵母菌，结合梯度离心技术制取细胞膜，以硅胶为载体制备酵母菌细胞膜固定相，成功制取以酪蛋白为基体的抗菌肽Cepep11。通过质谱技术（MALDI-TOF-MS/MS）分别鉴定出这些氨基酸残基序列依次为Arg-Val-Ala-Ser-Met-Ala-Ser-Glu-Lys-Met-Lys-Ile（Opep12），Gly-Leu-Ala-Arg-Cys-Leu-Ala-Gly-Thr-Leu（Apep10），Lys-Val-Phe-leu-Gly-leu-Lys（JCpep7），Cys-Ala-Ile-Leu-Thr-His-Lys-Arg（JCpep8）、Gly-Leu-Ser-Arg-Leu-Phe-Thr-Ala-Leu-Lys（ACWpep10）及Leu-Arg-Leu-Lys-Lys-Tyr-Lys-Val-Pro-Gln-Leu（Cepep11）。所得抗菌肽均有抗菌活性及稳定性，探究了不同抗菌肽的抗菌机理及不同细胞膜筛选差异性机制。将其应用于不同的食品体系，不仅改善了体系氨基酸组成还延长了保质期。该项目的研究结果对规模化开发利用新型抗菌肽资源，提高人类营养和健康水平具有重要意义。