跨损伤合成聚合酶Pol kappa新功能研究

DNA 损伤耐受机制能帮助细胞在DNA 损伤存在下继续复制DNA，从而避免细胞死亡。其中跨损伤DNA合成（TLS）利用特殊的DNA聚合酶直接在损伤的对面合成DNA。目前在已发现的15种哺乳动物TLS聚合酶中，聚合酶Pol kappa（Polκ）结构最为保守并且在体内基因组突变中起着非常关键的作用。应用激光显微照射技术在核內定点诱发单链断裂，我们发现哺乳动物细胞中Polκ能被招募到单链损伤位点（SSB），推测Polκ 可能存在TLS外的新功能，可能参与细胞内SSB修复，然而其调控机制还不清楚。本项目以野生型和Polκ基因敲除的小鼠胚胎成纤维细胞为研究对象，拟采用激光显微照射技术、彗星实验、免疫共沉淀等多种细胞、生化与分子生物学实验方法，重点研究Polκ在DNA链断裂修复中的作用和机制，探索Polκ的新功能，为了解肿瘤发生发展机制提供重要理论依据。

跨损伤DNA合成（TLS）是细胞应答DNA损伤的一种耐受机制，它利用特殊的DNA聚合酶直接在损伤模板对面合成DNA，避免复制叉停滞。在目前已知的10种体外具有TLS功能的哺乳动物聚合酶中，Y家族DNA聚合酶Pol kappa（Polk）具有高度保守的结构，并且与Polη和Polι相比，能够最为有效的跨越有机环境污染物在细胞中形成的BP-N2-dG损伤。研究发现，Polk 可以在BP-N2-dG对面正确掺入dC，而其在古菌中的同源物Dpo4介导易错旁路，易导致基因组的突变。最近一些研究提示TLS聚合酶在体内有其他TLS以外的DNA代谢方面的新功能。本研究中我们发现小鼠聚合酶Polk 在激光显微辐射（Laser micro-irradiation）诱导的DNA损伤位点募集，并且Polk 是通过其C末端（C-terminal）的PCNA结合区（PCNA-interacting peptide, PIP）、泛素锌指结构域2（ubiquitin zinc finger motif2, UBZ2）、核定位信号区（nuclear localization signal, NLS）被招募到Laser诱导的DNA损伤位点。这是Polk 有别于TLS以外的新功能。有趣的是这种招募在MSH2缺失的LoVo细胞和Rad18缺陷的细胞中显著减弱。进一步的观察发现Polk 缺失的MEF细胞对过氧化氢（H2O2）处理异常敏感，表现出单链和双链修复的双重缺陷。我们推测Polk 在体内氧化应激诱发的DNA链损伤修复过程中发挥着重要的作用。此外，我们对Polk 精确有效的跨越BP-N2-dG损伤合成机制也进行了深入的研究，最终发现：Polk 结构中的gap可以生理性的容纳庞大的芳香族加合物，其N-clasp是Polk 进行TLS过程中维持稳定性和灵活性的必需结构。本课题重点探索了跨损伤DNA聚合酶Polk 在TLS以外的新功能，同时也对其TLS功能展开了更深入的解析。这些研究拓宽和加深了我们对TLS聚合酶生理功能的认知和了解，为理解细胞面对环境污染产生突变的机理、肿瘤发生发展机制提供重要的理论基础。