细胞膜和DNA双重靶标抗菌肽的合成、筛选及抗菌机制研究

Antibiotic residues in animal products have threatened food security seriously. New agents with no veterinary drug residues and novel action modes were urgently needed than ever before. Antimicrobial peptides with no drug residues, difficult to produce drug resistance and diverse spectrum of antimicrobial activities caused widespread concern. Our previous study showed that antimicrobial peptide, Indolicidin (Inl) targets cell membrane and DNA to produce strong antimicrobial activities, but It has the defects of the poor enzymatic stability and strong cytotoxicity. In our present study, a series of Inl derivatives will be designed and synthsized to improve the antimicrobial activity, the stability in vivo and bioavailability by chemical modification, including unnatural amino acid subtitution, inersion of D-amino acid, pseudo-peptide construction and amino acid side modification. In order to get Inl derivatives with good stability, lower cytotoxicity and good activities, the in vitro and in vivo antimicrobial activity of all the derivatives against the wild type bacteria will be studied. Then, using molecular dynamics simulation, gel retardation assay, laser scanning confocal microscope and proteomics technology, we further clarify the exact mechanisms of these Inl derivatives. There is no doubt that the present study could get useful pre-drug moleculars and offer a new strategy and some excellent alternatives for designing new antimicrobial peptide antibiotics to defend the bacteria.

畜禽产品中抗生素残留问题严重威胁食品安全。因此，亟需发展无兽药残留、作用机制异于传统抗生素的新型抗菌药物。抗菌肽具有无残留、不易产生抗药性、生物活性谱多样等优点引起广泛关注。我们前期对抗菌肽Indolicidin（Inl）的研究结果显示，Inl以细胞膜和DNA为双重靶标产生较强的杀菌作用，但存在酶解稳定性差和细胞毒性强的缺陷。本课题拟采用非天然氨基酸替换、D型氨基酸替换、构建伪肽和引入新型侧链基团等手段对Inl进行修饰改造，结合体内、外抗菌活性、酶解稳定性和细胞毒性实验筛选出稳定性强、毒性低、活性好的抗菌肽Inl类似物。在此基础上，利用肽-膜分子动力学模型、凝胶阻滞实验、激光共聚焦显微镜分析技术、蛋白质组学技术，进一步探讨Inl类似物的抗菌作用机制。该研究有望筛选得到高效低毒抗菌肽药物前体分子，并为今后抗菌肽类抗生素药物设计提供思路和理论基础。

我们的研究主要在对抗菌肽活性研究以及酶解稳定性的改进方面。抗菌肽作为潜在的抗菌药物，在农业和食品领域具有一定的应用潜力，但是其酶解稳定性差的特点限制了其在生产中的应用。基于该目的，本项目基于具有应用前景的抗菌肽Indolicidin (Inl)开展，我们利用固相多肽合成方法合成了抗菌肽母肽Inl，同时基于母肽的基本空间结构，用固相多肽合成方法合成了项目计划的非天然氨基酸替换的抗菌肽Inl的类似物，包括Inl序列中全D型氨基酸替换、以及赖氨酸替换为Orn,Dab, Dap或者Agp，同时将精氨酸替换为Agp的类似物。按照项目计划对合成的Inl母肽及其类似物多肽进行空间二级结构、抗菌活性、溶血活性、酶解稳定性和抗菌机制进行了研究。结果显示，通过我们的结构修饰显著提高了Inl的抗酶解能力，而抗菌活性没有受到影响；另外对某些菌株通过我们结构修饰的类似物在一定程度上提高了抗菌活性。这是首次将Inl中的赖氨酸与精氨酸进行替换后进行的构效关系研究。在寻找Inl对照抗菌肽的过程中，根据前期积累，我们发现了从黄蜂polybiapaulista体内分离纯化的抗菌肽polybia-CP。我们利用固相方法合成了polybia-CP 肽，将限制性结构单元引入抗菌肽序列中，研究了其抗菌活性、作用机制及稳定性，达到了对抗菌肽分子的限制性结构修饰，即对抗菌肽的构象、疏水性、电荷等的影响最小，从而提高抗菌肽的酶解稳定性的同时而对其抗菌/抗真菌活性影响最小的目的。课题组在合成部分能用于抗菌肽限制性结构修饰的结构单元时，同时也探索发展一些新的结构或结构单元引入的新方法、新策略。尤其对Orn,Dab, Dap和Agp等非天然氨基酸的合成方法、构效关系方面积累了应用经验。这部分结果对于探索抗酶解活性多肽修饰结构单元具有应用意义。