蜘蛛α-螺旋阳离子抗菌肽的高通量筛选和功能研究

Antimicrobial peptides are different from traditional chemical antibiotics, and they function through interaction with the bacterial cell membrane, permeabilizing the phospholipid bilayer and eventually causing cell death. Moreover, some antimicrobial peptides can exhibit cytotoxic activity against tumor cells. In previous work,some antimicrobial peptides have also been isolated and characterized from spider venoms, and they almost certainly belong to alpha-helical cationic antimicrobial peptides. However, these results only provide a tantalizing glimpse of antimicrobial components in spider venoms. In the present study, we will use a combination strategy for high throughput screening of alpha-helical cationic antimicrobial peptides from spider venoms. This strategy consists of four steps: (i) enrichment of low-abundance peptides (including alpha-helical cationic antimicrobial peptides) from spider venoms by treatment with combinatorial hexapeptide ligand library; (ii) differentiating between neurotoxins and the other components (including alpha-helical cationic antimicrobial peptides) by mass spectrometric molecular weight information; (iii) mass spectrometric sequencing and PCR cloning for peptide identification; (iv) prediction of alpha-helical cationic antimicrobial peptides based on the online database tools. On the other hand, we will detect activities of these predicted antimicrobial peptides. Our investigation will provide a better understanding for molecular diversity, structure and function, and evolutionary relationship of antimicrobial peptides from spider venoms,and develop new candidate moleculars for peptide drug with completely independent intellectual property rights.

抗菌肽不同于传统的化学抗生素，它们直接与细菌细胞膜相互作用，通过增加磷脂层的通透性而杀灭细菌。而且，一些抗菌肽具有抗肿瘤细胞活性。先前的研究者已经从蜘蛛毒液中分离和鉴定到一些抗菌肽（几乎全是α-螺旋阳离子抗菌肽），但这仅仅是对蜘蛛毒液所含抗菌成分的初探。本项目采用结合的策略对蜘蛛α-螺旋阳离子抗菌肽进行高通量筛选。该策略包括四个步骤: 1）采用组合六肽文库法富集低丰度多肽成分（包括α-螺旋阳离子抗菌肽）；2）通过质谱鉴别分子量变化来区分神经毒素多肽和其他多肽成分(包括α-螺旋阳离子抗菌肽)；3）采用质谱测序结合PCR克隆技术鉴定多肽序列；4）通过在线数据库工具预测符合α-螺旋阳离子抗菌肽结构特征的多肽分子。另一方面，对以上预测的多肽分子进行活性检测。本项目的顺利实施不仅有利于更好地理解抗菌肽的分子多样性、结构和功能、进化关系，而且为创制具有完全自主知识产权的多肽药物提供新型候选分子。

蜘蛛毒液中含有多种生物活性成分，其中主要成分是具有3-5对二硫键的神经毒素多肽。近十余年来，国内外研究者也从蜘蛛毒液中分离和鉴定到一些抗菌肽（几乎全是不含二硫键的α -螺旋阳离子抗菌肽），但是数量非常有限。这主要是由于蜘蛛毒液的有限采集量以及抗菌肽的低丰度含量，导致抗菌肽的分离和检测成为十分棘手的难题。本项目采用结合的策略对黑腹狼蛛α-螺旋阳离子抗菌肽进行高通量筛选。该策略包括四个步骤: 1）采用反向色谱对黑腹狼蛛粗毒进行分离纯化；2）通过质谱鉴别分子量变化来区分神经毒素多肽和其他多肽成分(包括α-螺旋阳离子抗菌肽)；3）采用质谱测序结合PCR 克隆技术鉴定多肽序列；4）通过在线数据库工具预测符合抗菌肽结构特征的多肽分子。通过结合的策略，从黑腹狼蛛粗毒中一共鉴定到了50 个抗菌肽，可分为12 个家族。它们的长度很短（不超过30个氨基酸），整个分子均带净正电荷，其二级结构均呈α-螺旋结构。另一方面，通过对黑腹狼蛛抗菌肽的cDNA序列以及翻译的前体肽序列进行分析, 结果显示它们的cDNA长度一般约为1000bp以上，编码一个远大于成熟肽的抗菌肽前体。其前体肽由信号肽、中间肽、成熟肽组成，而且多个成熟肽表达于同一前体中，每两个成熟肽之间还有中间肽间隔。在成熟肽的C末端含有额外的氨基酸(GR或R),它们在翻译后加工过程中被切除。通过在抗菌肽数据库中进行同源性搜索，结果发现每个家族均具有高度同源性的抗菌肽。这些同源抗菌肽分别具有抑制不同革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、真菌，甚至抑制一些肿瘤细胞的活性。本项目的顺利实施不仅有利于更好地理解抗菌肽的分子多样性、结构和功能、进化关系，而且为创制具有完全自主知识产权的多肽药物提供新型候选分子。