泛素交联酶UbcH7在DNA损伤应答过程中的功能和机制分析

DNA damage response (DDR) plays a key role in genome stability maintenance, thereby providing an important target for anticancer therapy. Aberrant DNA damage response (DDR) is associated with tumorigenesis, resistance to chemotherapy and radiation treatment. In the presence of BRCA1 protein, cells are prone to perform homologous recombination (HR) to repair double-strand breaks(DSBs), while nonhomologous end-jointing (NHEJ) in G1-phase is used in the absence of BRCA1 or with enhanced 53BP1 retention. The latter manner usually leads to an increased sensitivity to anticancer therapies and cells death caused by impropriate genes arrangement. Our previous data showed that ubiquitin-conjugating enzyme H7 (UbcH7)-dependent ubiquitination and proteasome-dependent degradation are involved in the regulation of 53BP1 protein. Decreased UbcH7 level caused with RNAi or catalytically dead (C86S) mutant overexpression suppresses the degradation of 53BP1 and drives cells to perform nonhomologous end-jointing (NHEJ) repair, which bring about efficient cells death when treated with radiation or chemotherapy. Here, we would further investigate the function significance of UbcH7 in the process of DNA damage response based on our previous data. We would also identify the function region of UbcH7 protein and explore its potential role in short chain polypeptide medicine exploitation and clinical therapy. Based on the above, our results will provide more evidence for the role of UbcH7 and supply a new understanding for future anticancer therapy.

DNA 损伤应答对于维持细胞基因组稳定性至关重要，异常的DNA损伤应答和细胞癌变相关，并经常导致肿瘤细胞对放疗或化疗药物耐受。申请人前期工作表明，泛素交联酶UbcH7（Ube2L3）参与了抑癌蛋白53BP1的泛素化修饰及蛋白酶体途径降解，指导细胞采用同源重组的精细方式修复DNA双链断裂；UbcH7缺乏抑制53BP1的降解，使细胞选择易错方式修复DNA损伤，造成细胞对化疗和放疗药物敏感性增强，并最终导致高效的细胞死亡。本项目将依赖现有结果，利用shRNA筛选，蛋白质pull-down，DNA双链断裂修复分析等技术进一步阐述UbcH7在细胞DNA损伤应答中的功能机制；并以UbcH7为靶点，利用细胞生物学和生物化学等手段开发短肽类药物对抗细胞放化疗耐受。本研究将为肿瘤治疗提供一种更有加效地思路和方法。

DNA损伤应答(DDR)是重要的细胞生理活动之一，对细胞基因组稳定性维持至关重要，异常的DNA损伤应答常常和癌症发生及发展密切相关。人53BP1是关键的DNA双链断裂修复蛋白，其主要功能是拮抗BRCA1(Breast cancer type 1 susceptibility protein)的功能以决定细胞发生DNA双链断裂时的修复方式。BRCA1水平较高时，细胞选择HR（homologous recombination）的精确修复方式修复双链DNA断裂。反之53BP1水平较高时细胞选择NHEJ(nonhomologous　ends　jointing)的易错方式修复双链DNA断裂。我们的前期工作表明，作为泛素交联酶，UbcH7调控53BP1的泛素化修饰及蛋白酶体途径降解。其中的几个关键问题尚待解决：何种泛素交联酶E3参与了53BP1的泛素化修饰及蛋白酶体途径降解； 可否利用UbcH7对53BP1的调控关系以UbcH7为靶点开发抗肿瘤药物；除参与DNA双链断裂时的修复以外，53BP1是否还具有其他方面的功能。在本项目中，我们得初步结果显示，TRIM28有可能作为泛素连接酶E3协同UbcH7调控53BP1的降解过程。免疫共沉淀试验证实TRIM28和UbcH7存在相互作用。过量表达TRIM28下调了53BP1蛋白水平，而干涉TRIM28后则上调了53BP1蛋白。通过对UbcH7肽段序列的分析及细胞学试验，我们鉴定得到了能够抑制UbcH7活性的核心肽段并进行了初步优化及合成，我们得结果表明，以该核心肽段为基础的短肽药物可有效增加肿瘤细胞对DNA损伤的敏感程度，显示其有具有作为放化疗辅助联用药物的可能。 最后，我们发现了53BP1独立于DNA损伤修复蛋白之外的新的功能。 53BP1蛋白，特别是其C段片段能够形成一种独特的细胞核内点状分布（punctate nuclear pattern）。在无DNA损伤发生的情况下，53BP1可造成部分染色体片段凝集，且该定位和mTOR信号通路相关， mTOR抑制剂Rapamycin抑制了该种定位模式。进一步研究发现，53BP1该种定位模式和细胞基因组稳定维持，细胞自噬以及衰老密切相关。