基于全基因组序列的淋球菌候选疫苗筛选与鉴定

This subject intend to predict the outer membrane proteins (OMPs) localized possibly the cell surface of Neisseria gonorrhoeae by reverse vaccinology techniques, and respectively analyze its homology between known standard strains by amino acid sequence alignment, and reserve the conservative protein to sever as presumptive candidate antigens. The genes coding hypothetical candidate antigens should be respectively cloned and expressed in vitro by high-throughput, and recombinant proteins purified. Immune sera against recombinant proteins should be obtain by BABL/c mice inoculated. The location expressed of presumptive candidate antigens should be respectively screened by ELISA and fluorescence-activated cell sorter (FACS) using it’s corresponding serums, and detected its cross-immunoreactivity and cross-immunity protective immunity by using the Western blotting and serum bactericidal assay and epithelial cells adhesion inhibition test to identify the potential vaccine candidates against Neisseria gonorrhoeae.

本课题拟从已公布的淋球菌基因组序列信息中应用反向疫苗学技术，预测可能表达于淋球菌菌体表面的外膜蛋白，通过氨基酸序列比对分析其同源性，选取保守性较高的蛋白作为推定的外膜蛋白抗原。将推定外膜蛋白抗原基因进行高通量克隆和体外表达以纯化重组蛋白。重组蛋白免疫BABL/c小鼠，收获免疫血清。利用免疫血清通过ELISA和流式细胞术鉴定这些推定蛋白抗原是否表达在淋球菌菌体表面，并用Western blotting、血清抗体杀菌试验和上皮细胞粘附抑制试验分别检测免疫血清中抗体的交叉免疫反应性和交叉免疫保护性，以鉴定出有潜力发展为淋球菌疫苗的外膜蛋白抗原。

淋病是一种在世界上广泛流行的主要性传播疾病，其病原体为淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae，NG），俗称淋球菌。淋病的流行不仅危害患者健康，还可促进艾滋病的流行。已有的研究表明NG易反复感染，且易产生耐药性。因此，疫苗是预防和控制这种性传播疾病的关键措施，然而迄今为止，国内外尚无有效的疫苗能提供对淋病的特异性预防。对于NG这种抗原易于发生变异，而免疫原性又较弱的病原微生物，用传统疫苗学的方法研制疫苗显得力有不逮。随着微生物全基因组的测序项目正在呈现一个指数增长的过程以及生物信息学技术的兴起，使得从全基因组反向寻找微生物的有效抗原来研制疫苗成为可能。 .本项目从NG标准菌株FA1090全基因组数据中利用生物信息学技术反向筛选出了30个最有可能的表达在NG外膜的蛋白；再经同源性分析、T细胞表位和B细胞表位分析，最终筛选出26个外膜候选蛋白可作为疫苗进行研究。经克隆和原核表达，获得了16个可稳定表达并纯化的重组蛋白，免疫小鼠后均能诱导产生特异性的淋病奈瑟菌抗体。经膜定位的初步实验研究，发现16个预测的外膜蛋白全部表达在NG表面，表明本研究中采用的反向疫苗学技术预测NG外膜蛋白与实验研究结果一致。进一步用免疫斑点试验通过相应抗体检测这些外膜蛋白在不同NG标准株和临床分离株中的交叉免疫反应性，筛选出交叉免疫反应性较强的六种蛋白（YP_208618.1、YP_208090.1、YP_208423.1、YP_208748.1、YP_207737.1和YP_208054.1）深入进行免疫原性和免疫保护性的研究，结果发现YP_208618.1、YP_208423.1、YP_208054.1的免疫原性强于其他蛋白，YP_208090.1和YP_208054.1的血清抗体所提供的免疫保护效果较好。.本研究结果表明YP_208054.1兼有较好的免疫原性和免疫保护性，在疫苗研制中具有更好的应用前景，而YP_208618.1和YP_208423.1则具有更好的免疫原性和交叉免疫反应性，因而作为分子诊断靶点的研究潜力更大。