捻转血矛线虫H11蛋白复合物糖基化修饰特征及其对免疫保护作用的影响

Haemonchus contortus is an important gastro-intestinal nematode of ruminants. Its drug resistant problem is a global serious problem, therefore vaccine development is imminent. The native H11 protein complex can induce protective immunity in host, however, the efficacy of protective immunity of recombinant forms dramatically decreased, which hampered the development of a commercial vaccine. It is well known know that glycosylation of proteins is very important to immunogenicity of antigens, however, almost nothing is known about glycosylation of H11 and its effect on protective immunity. This project is aimed at comprehensively analyzing the characteristics of glycosylation and its relationship with protective immunity. The most advanced mass spectrometry techniques will be employed to determine the components of protein subtypes, the structure of glycan, sites of glycosylation and glycosylated peptide sequences. In addition, systematic bioinformatics analyses, animal experiments to validate the protective immunity of glycosylated proteins and recombinant proteins produced by CHO cell lines to be used in animal protective experiments will be carried out to elucidate the effect of glycosylation of H11 on the protective immunity. The complement of this project will not only elucidate the effect of glycosylation of the protective immunity of H11 protein complex, and also provide important foundation for further vaccine development, therefore having both academic significance and practical implications.

捻转血矛线虫是牛羊重要的消化道寄生线虫，其抗药性是全球范围的严重问题，因此疫苗开发迫在眉睫。该虫的天然糖蛋白复合物H11能够诱导宿主产生高水平免疫保护，但是重组蛋白保护效果却大大降低从而阻碍了疫苗的开发。相关研究提示糖基化修饰对抗原免疫原性十分重要，然而，迄今为止对于H11蛋白复合物的糖基化修饰特征及其对免疫保护影响几乎是一无所知。为此，本项目拟全面分析H11糖基化修饰特点并重点探究其与糖基化相关的免疫保护作用。拟选择最新的质谱技术确定其蛋白质组成、聚糖结构、糖基化位点以及糖基化肽段序列，并通过系统生物信息学分析、H11糖基化相关的免疫保护性功能验证以及CHO细胞系重组糖蛋白的免疫保护实验来深入探究糖基化修饰对H11重要糖蛋白的免疫保护功能的影响。本课题的完成将不仅阐明糖基化修饰对于H11蛋白质复合物免疫保护性的影响作用，并可为进一步疫苗的开发奠定坚实基础，具有重大学术意义及重要实践意义。

寄生线虫是感染人类和动物的重要病原体，它们在全球范围内造成破坏性疾病和社会经济损失。目前线虫已对几乎所有驱虫药产生耐药性，使其控制面临严峻挑战。然而仅开发出一种有效疫苗（Barbervax）以保护反刍动物抵抗最强致病性吸血寄生线虫–捻转血矛线虫。Barbervax疫苗包含捻转血矛线虫两种关键肠道天然蛋白，称为H11和H-gal-GP。其中，单独的免疫H11蛋白能够诱导动物产生90%以上的保护，但其重组形式却没有保护力。本项目提出假设：H11蛋白N-糖基化修饰在其诱导保护性免疫中发挥关键作用。项目执行四年期间，课题组的研究紧密围绕项目书设定的内容和目标进行完成。利用高精度生物质谱技术全面解析了捻转血矛线虫和H11抗原N-糖蛋白组和N-糖组结构特征，通过动物实验评估了H11蛋白N-糖基化修饰在其诱导保护性免疫中的关键作用，并利用中国仓鼠卵巢细胞重组表达H11糖蛋白评估其免疫保护效果，目前本项目要求的内容已经全部完成。捻转血矛线虫糖蛋白组学和糖组学分析显示，共鉴定到291个糖蛋白和25个聚糖信号峰，这些糖复合物主要表达在捻转血矛线虫肠道和性腺部位。对于H11抗原，糖蛋白组学分析鉴定到85个N-糖蛋白和125个N-糖基化位点；糖组学分析识别到38个N-糖结构，其中以高甘露糖和复杂型聚糖为主，并涉及一系列已知免疫原性聚糖表位。进一步研究表明，H11抗原N-糖结构对诱导动物产生免疫保护及保护性IgG抗体至关重要，并且该IgG抗体能够靶向捻转血矛线虫肠道微绒毛，抑制成虫肠道消化酶活性和体外幼虫生长发育。在重组蛋白的免疫学研究中，利用中国仓鼠卵巢细胞重组表达的H11-2蛋白接种山羊，使其减卵率和减虫率分别达到67.1%和63.5%，提示可以作为潜在的抗捻转血矛线虫疫苗候选分子。相关研究已经发表研究论文8篇，包括Frontiers in Immunology、Computational and Structural Biotechnology Journal、Vaccines等杂志；培养研究生8名，其中1名获得博士学位，5名获得硕士学位。本项目首次阐述了蛋白质糖基化修饰在寄生线虫保护性免疫中的关键作用，对动物寄生虫的疫苗开发具有重要学术意义和潜在应用价值。