捻转血矛线虫Hc-dhs-28基因调控虫体发育的作用机制

A down-regulation of enzymes in Haemonchus contortus from the fatty acid β-oxidation process is shown, because of the low oxygen tension in the host abomasums, one stage called Parasitism, the other free-living stage. A new gene Hc-dhs-28 was discovered during the research on nematode development, which shows extremely homologous to the gene Ce-dhs-28, coding long chain fatty acid dehydrogenases from the model organism Caenorhabditis elegans; the protein functional domains are similar to the human 17-beta-hydroxysteroid dehydrogenase IV functioning in the peroxisomal fatty acid β-oxidation. RNAi in C. elegans employed the dsRNA of Hc-dhs-28 led to fatty acid accumulation in nematode bodies, which is similar to the pattern in Ce-dhs-28 mutant of C. elegans. Hc-dhs-28 probably therefore involves the peroxisomal fatty acid β-oxidation as a key enzyme, which play an important role in H. contortus development. In this project, gene structure of Hc-dhs-28 is to be characterized firstly, followed with the enzyme activity description of Hc-DHS-28. And more work will focus on its physiological functions both in the free-living stage and parasitic stage. The results will provide great proofs directly on fatty acid metabolism of parasitic nematodes to meet the aerobic or anaerobic environment, and will direct theoretically the following research on the unique development of parasitic nematode.

捻转血矛线虫具有两个生活阶段，普遍认为在寄生阶段，营自由生活时期发生的脂肪酸β-氧化作用会因宿主体内的微氧环境而受到抑制。申请者所在团队研究线虫发育机制过程中获得了1个与模式生物秀丽隐杆线虫的长链脂肪酸脱氢酶基因同源的新基因Hc-dhs-28；其功能域与人过氧化物酶体内脂肪酸β-氧化的限速酶17β-羟基类固醇脱氢酶 Ⅳ相似；对秀丽隐杆线虫进行的RNAi能引起虫体内出现明显的脂肪积聚，形成与Ce-dhs-28突变体相似的表型。因此，Hc-dhs-28可能作为关键酶基因参与捻转血矛线虫过氧化物酶体的脂肪酸代谢，影响其发育。本项目拟从Hc-dhs-28的基因结构和Hc-DHS-28的酶活性研究切入，重点分析该基因参与线虫有氧和微氧生活阶段具体的生理功能，预期研究结果将为寄生线虫有氧与微氧环境中脂肪酸的代谢机制提供直接证据，对揭示寄生线虫独特的生长发育机制具有重要的理论指导意义。

捻转血矛线虫寄生于反刍动物皱胃以吸血为生，严重影响养殖业发展。防治手段主要依赖化学药物，而近年来耐药现象频繁出现使得药物防控效果日渐减弱。筛选新型药靶及疫苗开发是防治方法研究的重要方向。捻转血矛线虫滞育机制使其能够躲避不利环境对自身的影响，是虫体生存的重要保障之一。探明该机制的参与因子，对掌握虫体发育调控机制进而实现该病的防控有重大意义。本研究扩增获得新基因Hc-dhs-28，其cDNA全长1317 bp，DNA全长4615 bp，含有13个外显子和12个内含子；分析预测发现具有短链脱氢酶及SCP 2类固醇结合域两个功能域，C端具有SKL过氧化物酶体定位信号1（PTS 1）；表达特性分析发现其在滞育和自由生活阶段转录水平较高，表达部位集中于肠道和皮下，寄生阶段转录和表达水平均较低；通过原核表达获得正常Hc-DHS-28和功能域关键位点突变重组蛋白，并进行体外酶活动力学试验，证实该蛋白具有短链羟酰基辅酶A脱氢酶功能活性，且121、149、162、166位氨基酸为活性关键位点；在HEK293细胞中观察Hc-DHS-28与过氧化物酶体及线粒体的共定位，发现PTS1定位信号SKL能在C端末尾发挥过氧化物酶体定位功能，并帮助蛋白表达于细胞质过氧化物酶体中；利用C. elegans研究其对线虫发育调控的作用，发现与前期表达定位结果一致即集中表达于肠道及皮下；能部分拯救Ce-dhs-28功能缺失VS8缺失株虫体的体长、产卵量等指标，并能延长虫体在饥饿应激下的寿命；对野生株RNAi后包含Ce-dhs-28在内的整条过氧化物酶体脂肪酸β氧化通路中的基因转录水平均显著下降，且虫体体长缩短，产卵量下降，出现脂肪沉积和大脂滴，虫卵滞留现象严重，饥饿应急下不能进入滞育而死亡；利用原核表达蛋白进行免疫保护试验，发现Hc-DHS-28重组蛋白具有良好的免疫原性，且免疫绵羊后能显著减弱感染捻转血矛线虫后的体重损失，降低虫荷量，使线虫排卵高峰期提前，缩短雌虫体长。本研究明确了Hc-dhs-28基因在虫体发育调控过程中的功能，验证了其作为疫苗候选抗原的潜能，为后续进一步探索线虫滞育形成机制及药靶筛选和疫苗开发奠定了坚实的基础。