樟叶越橘中熊果苷咖啡酰基转移酶的基因克隆与功能分析

芳香族酰基转移酶功能基因在许多重要植物次生代谢产物（如呈现不同花色的酰化花色苷类和紫杉醇类等）的生物合成中扮演着重要的角色。申请者首次发现具有优于熊果苷生理活性的6'-O-咖啡酰基熊果苷（CA）以22%的罕见高含量存在于樟叶越橘中，提示该植物中高活性表达的熊果苷咖啡酰基转移酶（VdAHCT）及其产物CA可能具有重要的、不可或缺的生物学功能。但CA的生物合成关键酶，即以熊果苷为酰基受体的咖啡酰基转移酶及其基因克隆至今尚无研究报道。本项目拟在前期工作基础上，以该植物幼嫩叶芽为材料提取总RNA，采用RT-PCR和RACE-PCR等分子生物学实验技术，克隆VdAHCT基因全长cDNA，对其序列进行同源性比较和系统进化树分析，通过原核表达，目的酶蛋白分离纯化和体外酶活性验证进行功能阐明。研究结果将为进一步阐明樟叶越橘中VdAHCT及其产物CA的生物学功能以及该植物中高含量CA的形成机制奠定科学基础。

本项目在已有前期研究工作的基础上，采用化学生物学研究手段开展了樟叶越桔（原变种）（Vaccinium dunalianum var. dunalianum）的ITS序列分析、主要化学成分的含量分析、叶芽总RNA提取方法筛选、高通量转录组测序分析、咖啡酰基转移酶和熊果苷合成酶的基因克隆和分析、基因异源表达和组织培养等相关研究，从樟叶越桔叶芽中克隆得到3条芳香族酰基转移酶基因（VdAT1、VdAT2和VdAT3）和2条熊果苷合成酶基因（VdAS4和VdAS6）cDNA全长，并对它们进行了生物信息学分析和功能预测。构建了VdAT2基因原核表达载体并表达、纯化获得其重组蛋白。体外酶活实验初步结果显示，6'-O-咖啡酰熊果苷可能为绿原酸:羟基桂皮酰基转移酶的催化产物。研究结果将为进一步阐明樟叶越桔6'-O-咖啡酰熊果苷的高产机制及其生物学意义提供基础，同时也为樟叶越桔植物资源的可持续利用以及寻找6'-O-咖啡酰熊果苷高产性状的近缘替代资源等提供参考。研究结果已发表研究论文3篇，已接受发表SCI期刊论文2篇，申请专利2项。通过本项目的开展，已培养硕士研究生2名。