催化柴胡单体皂苷生物合成的糖基转移酶基因克隆与功能分析

很多重要药用植物体内存在多种单体皂苷，不同单体皂苷具有不同的药理活性。皂苷生物合成途径下游，糖基转移酶催化糖与苷元形成皂苷，糖基种类及糖基化位点不同，形成的皂苷种类就不同。但目前编码皂苷合成的糖基转移酶的UGT基因绝大多数没有克隆与鉴定，因此对酶识别的底物特异性和催化反应特性等单体皂苷形成机制尚不清晰，难以有针对性的开展目的单体皂苷的调控研究。课题组通过cDNA文库构建和RACE方法，获得了大宗药材北柴胡的1个全长UGT基因；利用高通量测序，从20余万reads中获得了25个糖基转移酶cDNA序列。在此基础上，本项目将从25个糖基转移酶cDNA序列中克隆筛选催化柴胡单体皂苷合成的UGT基因，RACE方法获得全长。对获得的全部全长UGT基因研究其编码酶催化的底物特异性及抑制和过量表达基因对单体皂苷形成的影响。研究将为阐明单体皂苷多样性形成机制，有目的地调控有药理活性的单体皂苷合成奠定基础。

本项目按计划进行了可能参与柴胡皂苷生物合成的糖基转移酶基因筛选克隆。获得以下研究结果：（1）分析柴胡转录组454测序结果，汇总了其中49个UDP-糖基转移酶（UGT）基因。将49个UGT基因逐一利用NCBI在线BlastX比对，查看每个UGT基因比对上的其它来源UGT基因功能。49个UGT基因分属于9个UGT家族，包括目前可见报道的参与三萜皂苷生物合成UGT基因所属于的UGT71、UGT73、UGT74和UGT91家族。（2）利用qRT-PCR分析了选择出的20个UGT的MeJA诱导表达，8个UGT的组织表达特性。初步筛选出3个UGT可能参与柴胡皂苷生物合成。（3）49个UGT中有2个含有完整编码区，对其进行了RT-PCR重新克隆和验证。利用RACE方法，进行了其它UGT全长cDNA克隆。加上课题组在项目批准前已获得一个UGT基因，总计7个柴胡UGT基因全长克隆，分别命名为BcUGT1, BcUGT2, BcUGT3, BcUGT4, BcUGT5, BcUGT6和BcUGT7。通过构建系统进化树，其中BcUGT3和 BcUGT6 与功能已验证的参与三萜类化合物合成UGT有较高氨基酸序列同源性，可能参与柴胡皂苷生物合成。利用RACE方法克隆了筛选出的3个UGT基因全长，序列分析其中两个为同一基因，命名为BcUGT10，另一个命名为BcUGT8。（4）利用qRT-PCR分析了BcUGT1、BcUGT3、 BcUGT6、BcUGT8、BcUGT10的MeJA诱导表达特性和组织表达特性。（5）构建了5个UGT基因原核表达载体，通过诱导条件摸索（表达载体和菌株选择，诱导温度和诱导物浓度等条件改变），成功诱导了4个UGT（BcUGT1，BcUGT3，BcUGT6和BcUGT10）在大肠杆菌中的表达。进行了BcUGT10体外表达蛋白催化活性鉴定。（6）构建了BcUGT10基因过表达和抑制表达转基因载体。建立了北柴胡花药愈伤组织高效稳定的再生体系。进行了UGT10转基因实验。（7）利用发根农杆菌建立了北柴胡毛状根诱导体系。将带有UGT基因载体的发根农杆菌侵染诱导出了毛状根。（8）探索建立VIGS用于柴胡基因功能研究的方法体系，VIGS病毒载体接种不成功。本项目为进一步深入研究皂苷合成途径及其调控奠定了基础。共发表标注论文10篇，其中SCI论文2篇。培养研究生4名，已毕业2名。