黑色素生成抑制天然产物6'-O-咖啡酰熊果苷的生物合成及其生产调控

Our previous study found that 6'-O-Caffeoylarbutin (CA) with both stronger anti-melanogenic activity and safety than those of arbutin appeared in the buds of Vaccinium dunalianum (Ericaceae) with rare high content of 23% (dry weight). The results suggested that CA and its related biosynthetic key enzymes may possess important biological functions in the titled plant. However, it is still unknown concerning of the biosynthetic pathway of CA, the related key enzymes, as well as the control mechanism for producing CA. In order to clarify the biosynthetic pathway of CA and the effects of various elicitors and exogenous substrates on the suspension cell and adventitious root cultures of V. dunalianum for producing CA, this project is going to analysis the content and variation of CA, to isolate the enzymetic products,to purify the key enzymes in its biosynthetic pathway, and to study the enzymatic kinetics and substrate specificity, using suspension cells and adventitious root cultures of V. dunalianum. The results will not only explain the high yield mechnism and biological significance of CA in V. dunalianum, but also provide the scientific supports to the introduction and domestication, breeeding, and sustainable utilization of V. dunalianum.

申请者前期研究发现，黑色素生成抑制活性和安全性均优于熊果苷的6'-O-咖啡酰熊果苷（CA）以罕见的高含量形式存在于杜鹃花科越桔属野生植物樟叶越桔（Vaccinium dunalianum）的叶芽中，提示CA及其生物合成关键酶在该植物中可能具有某种重要的、不可或缺的生物学功能。然而迄今为止有关樟叶越桔中CA的生物合成关键酶、生物合成途径、及其生产调控机制仍不清楚。本项目拟在前期工作基础上，采用化学生物学等研究方法，通过樟叶越桔悬浮细胞培养系/不定根培养系中CA含量及其动态变化分析、生物合成关键酶目的产物分离鉴定、目的酶的分离纯化、酶动力学和底物特异性等研究，阐明CA的生物合成途径，并探讨多种诱导子及外源性底物对悬浮细胞培养系/不定根培养系中CA生产调控上的影响，为进一步诠释樟叶越桔CA的高产机制及其生物学意义，以及该植物的引种驯化、品种选育和可持续利用提供科学依据。

前期发现黑色素生成抑制活性和安全性均优于熊果苷的6'-O-咖啡酰熊果苷（CA）以罕见高含量存在于杜鹃花科越桔属樟叶越桔（Vaccinium dunalianum）的叶芽中，提示CA及其生物合成关键酶在该植物中可能具有某种重要的、不可或缺的生物学功能。本项目采用组织培养方法分别建立了樟叶越桔组培苗及其快速繁殖体系、不定根培养体系和悬浮细胞培养体系，分析了不同培养基、不同激素类型及浓度、不同碳源、不同基质、不同培养条件等对各培养体系的影响；分析了不同激素对离体培养樟叶越桔CA等次生代谢产物生产调控的影响；对樟叶越桔CA相关功能基因和内参基因—熊果苷合成酶基因VdAS1、糖基转移酶基因VdUGT1、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因VdGAPDH1、ARPs亚家族基因VdARP7等进行了克隆与表达分析；通过樟叶越桔叶芽转录组数据挖掘和分析，阐明了CA的分子合成通路，咖啡酰基CoA、绿原酸及HCA-Glc作为酰基供体，熊果苷作为受体，在VdAT基因家族表达产物催化下合成CA，而VdAT2基因表达产物可能主要参与CA合成，VdAS1基因表达产物可能主要参与了熊果苷的合成；阐明了不同土壤水分处理对樟叶越桔植株CA等代谢产物的生成和芳香族酰基转移酶基因VdAT和熊果苷合成酶基因VdAS表达的影响；从樟叶越桔叶、果实和根中共分离鉴定了20余个化合物，其中新化合物3个；优化了CA的水提取条件和超声波辅助甲醇提取条件；研究发现CA具有显著的降血脂、抗炎活性、肝保护和血栓形成抑制活性；完成了樟叶越桔内生真菌的分离鉴定，发现大多数内生真菌具有较强的农业病害菌抑制活性；发现根中优势内生真菌二形伞霉在干旱胁迫条件下能够提高拟南芥种子的活力及萌发率、显著促进其根系生长，并从其大米固体发酵物中分离得到宿主中的目标代谢产物CA及其类似物。研究结果为进一步阐明樟叶越桔中CA的高产机制、生物学意义及其在生物医药和大健康等领域上的开发利用提供了科学基础。已发表相关论文14篇，其中SCI收录期刊4篇，北大中文核心期刊10篇，申请发明专利2项（已授权1项），培养硕士生9名（已毕业8名）、在读博士生1名。