膜片钳测序研究视网膜自主感光神经节细胞亚型的转录组基因表达

Intrinsically photosensitive retinal ganglion cells (ipRGCs), which express the photopigment melanopsin, are photosensitive independent of photoreceptors. It is mainly divided into five subtypes, M1-M5. The subtypes play an important role in different behaviors such as circadian rhythm and pupillary regulation. In diseases and injury, it shows special ability of survival, repair and regeneration. This project proposes that different subtypes of ipRGCs each constitute an independent transcriptomic types with specific marker genes, and the difference of gene expression in subtypes is the basis of their physiological and pathological differences. In the preliminary experiment, we established the study methods of using patch-seq technique on retinal ganglion cells. The technique can correlates photoreaction, morphology and sequencing at the single-cell level to simultaneously obtain precise cell classification, transcriptome expression profiling and functional maps. This project intends to use this technology to comprehensively decipher the transcriptome gene expression, photoreaction and morphological characteristics of each subtype of ipRGCs, and obtain subtype marker genes, photoreactive pathway genes, specific enrichment expression of disease, repair, and regeneration related genes. The accomplishment of this project will provide valuable insights and potential therapeutic targets for the precise treatment of ipRGCs-associated ophthalmopathy and for the protection and repair of neurons in retinal damage and degenerative diseases.

视网膜的自主感光神经节细胞（ipRGCs）表达感光蛋白,能够不依赖于感光细胞感受光刺激，主要分为五个亚型M1-M5。各亚型ipRGCs在不同行为比如昼夜节律、瞳孔调节中有重要作用，在疾病、损伤中显示特别的存活和修复再生能力。本项目提出ipRGCs各亚型构成独立的转录组类型，有特异的标志基因，其基因表达差异是生理病理差异的基础。预实验中，我们建立了在视网膜神经节细胞上使用膜片钳电极获得RNA（膜片钳测序）的研究方法，可在单细胞水平将光反应，形态和基因表达相关联，从而同时获得细胞的精确分类、转录组表达和功能图谱。本项目拟使用该技术全面解析ipRGCs各亚型的转录组基因表达、光反应和形态特征，以获得亚型的标志基因，光反应通路基因，疾病、损伤、修复基因的特异性富集表达。本项目的完成将为精准治疗ipRGCs相关眼病，以及为视网膜损伤和退行性疾病中的神经保护和修复提供宝贵思路和潜在的治疗靶点。

视网膜自主感光神经节细胞（ipRGC）表达黑视素蛋白，可自主感光，并投射至许多大脑的非图像加工及图像加工脑区，参与重要的生理功能，如节律调节、瞳孔反射、对比度识别等，特别是近年来发现这些细胞参与视网膜的发育、情绪的调节等。 ipRGC根据不同的形态、光反应特征可分为6个亚型，其亚型内部仍有性质上的多样性，分子基础并不清楚。近年来，虽然有单细胞测序数据中包含了一些ipRGC数据，但ipRGC在视网膜神经节细胞中仍然是稀有类型，仅占5%，因此数量非常有限，且分离的细胞中也不包含特征及位置信息。膜片钳测序技术可以在单个细胞上上同时获得位置、电生理、光反应特征、形态及转录组基因表达，可全面鉴定ipRGC的特征及其和基因表达的关联。.本项目主要在M1、M2（M3）和M4亚型上进行了膜片钳测序研究。通过转基因小鼠opn4-tdtomato，我们可以标记到M1、M2、M3和少量M4；通过寻找较大的细胞体结合SMI32染色以及持续性on的光反应特征，我们可以鉴定M4神经元。在这些神经元上，我们进行了膜片钳测序研究。至结题之前，我们共在约124个ipRGC（和一些alpha-off细胞）上进行了电生理记录，87个细胞上进行了光反应记录并获取了RNA，RNA合格率达到80%以上，RNA测序分析及形态染色正在进行中。.本项目完成了对ipRGC神经元的标记和鉴定，在视网膜上建立膜片钳测序技术方法，以及在ipRGC神经元上进行膜片钳测序获得了多模态数据的主体部分，但尚未发表文章。项目培养一名硕士生，将于明年答辩。项目投入经费21万，支出17.51.万，各项支出基本与预算相符。剩余经费3.49万元，计划用于本项目研究后续测序及抗体验证费用。