功能化富勒烯衍生物增强免疫活性作用机制的研究

因其特殊的表面性质、化学组成、尺度形状等理化特性，富勒烯及其衍生物在生物应用领域前景广阔，其生物活性的研究越来越深入，但是对免疫系统作用机制的研究较少。免疫系统具有双面性，过度激活或抑制都会引起疾病的发生。研究不同表面修饰和内容物的富勒烯衍生物对原代免疫细胞功能的影响及作用机制是本项目的重要内容。利用共聚焦显微镜初步确定富勒烯衍生物在免疫细胞中的定位与分布，推测免疫细胞对其吸收、转运和清除的机制；利用基因芯片分别筛选单独培养以及与肿瘤细胞共培养的免疫细胞由功能化富勒烯衍生物处理前后差异表达的基因，发现其关键转录因子，初步推导活化该转录因子的信号转导通路。初步解释不同表面修饰和内容物的富勒烯衍生物分别通过何种信号通路调节免疫细胞的功能及其彼此之间的联系，从分子、蛋白以及细胞水平系统的研究功能化富勒烯衍生物的免疫学机制，为拓展富勒烯及其衍生物在生命科学领域的应用提供必要的理论和实验基础。

多羟基化富勒烯衍生物尤其是内包金属富勒醇被证实是一种高效低毒抗肿瘤化学治疗剂，对免疫系统具有较好的调节活性，但相关机制尚不清楚。本项目以免疫细胞为研究对象，对经典的富勒醇衍生物Gd@C82(OH)22和C60(OH)22的免疫调节特性及相关机制进行了探讨。基于同步辐射技术，我们利用软X射线扫描透射显微镜首次观察到巨噬细胞对金属富勒醇的持续性摄入及其在细胞内的分布，证实金属富勒醇能被免疫细胞摄取并发挥作用。巨噬细胞被活化，细胞增殖能力及吞噬能力明显增强，分泌的前炎症因子IL-1b，IL-18明显增多。通过检测Gd@C82(OH)22和C60(OH)22处理后巨噬细胞的蛋白表达，发现富勒醇能够促进caspase-1的活化继而上调NLRP3的表达水平。通过小RNA干扰实验，进一步证实NLRP3炎症小体而不是NLRC4炎症小体参与了富勒醇介导的IL-1b，IL-18的生成。而相关的上游影响因素，如钾离子外流和P2X7受体的激活对于富勒醇介导的NLRP3炎症小体的活化以及IL-1b的生成也是必需的。与其它材料不同，富勒醇不需要任何辅助刺激物如LPS的预处理就能够独立促进巨噬细胞分泌IL-1b。这一结论通过检测IL-1b的mRNA和pro-IL-1b的蛋白表达进一步被证实。利用MyD88、TLR4和TLR2基因敲除小鼠，我们发现富勒醇通过激活细胞上的TLRs启动信号转导从而引起炎症应答。有意思的是，Gd@C82(OH)22主要通过TLR4/MyD88 途径发挥作用，与TLR2无关。而C60(OH)22则是表现出对多种TLRs/ MyD88通路甚至是非MyD88依赖途径的激活作用。至此，我们的工作证实了富勒醇衍生物能够显著地活化巨噬细胞，并且同时通过TLRs/MyD88/NF-κB通路和激活NLRP3炎症小体两条途径促进前炎症因子IL-1b的生成。同时，我们体外建立了共培养体系来模拟体内巨噬细胞对肿瘤细胞早期生长的影响。发现加入富勒醇后，肿瘤细胞的生长被明显抑制，而富勒醇本身对肿瘤细胞并没有直接的杀伤作用。我们发现尤其是在Gd@C82(OH)22处理组，多达10种以上的细胞因子被上调了3倍以上。这一结果可以更好的解释Gd@C82(OH)22比C60(OH)22更出色的抗肿瘤效果。本部分工作仍在继续深入进行中。