基于功能基因-酶二元递进式分析思路的18α-甘草酸形成的分子机制研究

The applicant found that about 97% Glycyrrhiza uralensis plants (licorice, Gancao in Chinese) contained two glycyrrhizin epimers, 18α-glycyrrhizin and 18β-glycyrrhizin, while about 3% G. uralensis plants only contained 18β-glycyrrhizin. Because 18α-glycyrrhizin has a better lipotropy, a stronger anti-inflammatory activity, a higher targeting and fewer adverse reactions comparing with 18β-glycyrrhizin, it is the evaluation index of high quality licorice. It is very important to reveal the molecular mechanism of 18α-glycyrrhizin biosynthesis for the molecular breeding of high quality licorice. Many researches have shown that β-amyrin synthase is the key enzyme for glycyrrhizin skeleton formation. The applicant also found that β-AS gene polymorphism influenced the production of glycyrrhizin epimers. Therefore, the applicant proposes a hypothesis “functional gene-enzyme variation is the molecular mechanism for 18α-glycyrrhizin biosynthesis”. Based on the above hypothesis, the applicant will investigate β-AS gene polymorphisms, screen the specific β-AS genes corresponding to the deficiency and high accumulation of 18α-glycyrrhizin, analyze the activities of enzymes encoded by the specific β-AS genes, and progressively reveal the molecular mechanism for 18α-glycyrrhizin biosynthesis. This project will provide new basis for high quality licorice breeding and guidance for similar studies in other medicinal plants.

申请者前期研究发现约97%的甘草植株中同时含有18α-和18β-两种甘草酸差向异构体，而约3%的甘草植株为18α-甘草酸缺失型。由于18α-甘草酸具有亲脂性好、抗炎活性强、靶向性高、不良反应少等优点，因此18α-甘草酸是优质甘草的评价指标。阐明18α-甘草酸形成的分子机制，对于优质甘草的分子育种具有重要意义。前人报道β-香树脂醇合成酶（β-AS）是形成甘草酸骨架的关键酶，申请者也发现β-AS基因多态性与甘草酸差向异构体的形成相关。因此，申请者提出“β-AS基因-酶变异是18α-甘草酸形成的分子机制”的假说。基于以上假说，申请者拟在前期研究的基础上，首先考察甘草β-AS基因的多态性，筛选18α-甘草酸缺失及高水平积累对应的β-AS基因型，再从编码酶水平进行解析，从而递进式地揭示其分子机制。本课题不仅为甘草优良种质选育提供新的依据，而且对其他药用植物的同类研究具有指导意义。

申请者前期研究发现甘草中同时含有18α-和18β-两种甘草酸差向异构体，由于β-香树脂醇合成酶（β-AS）是形成甘草酸骨架的关键酶，因此申请者提出“β-AS基因-酶变异是18α-甘草酸形成的分子机制”的假说，并开展了如下研究：60株甘草样品中18α-甘草酸与18β-甘草酸的含量分析；β-AS基因多态性分析；β-AS基因相对表达量分析；特异β-AS基因的筛选与克隆；特异β-AS基因在毕赤酵母GS115中的异源表达与酶活分析。本课题共获得了11种甘草β-AS基因单倍型，编码5种氨基酸序列类型；Real-time PCR结果显示在不同甘草样品间β-AS基因表达水平差异显著，18α-甘草酸与18β-甘草酸的高水平积累与β-AS基因的高水平表达具有正相关关系；筛选出β-AS基因单倍型3（GenBank登录号：KY363341）为甘草酸高含量样品的特异β-AS基因型，β-AS基因单倍型8（GenBank登录号：KY363346）为18α-甘草酸缺失及18β-甘草酸低含量样品的特异β-AS基因型；毕赤酵母GS115异源表达结果显示GS115-pPIC9K-BAS-3中β-香树脂醇含量（0.1021 mg/g，S=0.0083）显著高于GS115-pPIC9K-BAS-8中β-香树脂醇含量（0.0795 mg/g，S= 0.0137），故前者β-AS酶的催化活性显著高于后者，即：β-AS基因单倍型3较单倍型8更有利于甘草酸的生物合成。课题组从β-AS基因多态性和表达酶活性两个层面进行递进式分析，圆满完成了本课题的所有实验任务，为解析甘草酸生物合成的分子机制、提高栽培甘草的质量奠定了基础。