苦荞种子芦丁降解酶的基因沉默及其对次生代谢物累积的调控

苦荞含有较甜荞更为丰富的功能成分-芦丁,但其籽粒中含有高活性的特异表达的芦丁降解酶，在食品加工过程中会将芦丁迅速降解，制约了荞麦的高芦丁育种及其保健功能的发挥。本项目针对国际上关于芦丁降解酶研究的空白和薄弱环节，拟在通过基因组步移获得苦荞芦丁降解酶启动子序列的基础上，以本实验室已克隆的芦丁降解酶基因为对象，构建芦丁降解酶的RNA干扰载体。采用农杆菌介导法转化苦荞，获得芦丁降解酶表达沉默的转基因植株群体。通过实时定量PCR筛选芦丁降解酶表达沉默的植株；利用芦丁降解酶的多克隆抗体检测目标基因产物的表达；对基因沉默植株籽粒的芦丁及其它次生代谢物的含量、以及籽粒在萌发过程中对其它植物的化感作用进行分析。研究结果对于苦荞高芦丁优良种质资源的创制以及揭示芦丁降解酶的生物学功能有重要的理论价值和应用前景。

项目针对苦荞芦丁降解酶基因克隆和功能研究的薄弱环节, 通过蛋白质N端测序及二级质谱获得的内肽序列并结合转录组数据，克隆了芦丁降解酶的基因，并对芦丁降解酶的基因结构进行了系统的分析，证明苦荞芦丁降解酶是尚未报道的新基因，其与GenBank报道的基因存在低同源性，其在苦荞基因组上至少存在三种结构形式；以克隆的基因为起始完成了该酶的原核表达和毕赤酵母重组表达，毕赤酵母表达的重组酶具有水解芦丁的活力，但在糖基化修饰方式上与天然酶存在差异。芦丁降解酶表现出对有机溶剂的高度耐受性。通过基因组步移克隆了芦丁降解酶启动子序列，以5′端缺失的方式研究芦丁降解酶的上游调控序列，并对启动子响应外源信号物质的调控规律进行了分析；构建了芦丁降解酶的RNAi载体和过表达载体，采用建立的农杆菌介导法转化苦荞，获得了芦丁降解酶表达沉默和过表达的转基因植株群体。建立了高通量的转基因材料直接PCR筛选的技术体系。研究结果为揭示芦丁降解酶的生物学功能和苦荞次生代谢物的调控机制奠定了坚实基础。