内皮素受体A-药物相互作用快速分析受体色谱方法的建立与评价

Investigation of protein-drug interaction plays vital roles in drug mechanism revealing and innovative drug discovering. In previous studies, we have constructed a series of receptor chromatography and successfully applied them in receptor-drug interaction analysis. However, they are still urgently to be improved ascribed to the affinity chromatographic common problems of long operating time and intensive drug quantities. To address these issues, this proposal intends to establish a new protocol with endothelin receptor subtype A (ETA) as a probe. Human epidermal growth factor receptor intracellular tyrosine kinase domain will be fused to the carboxyl terminal of ETA. The recombinant receptor is stable-expressed in human myeloid leukemia cell line. Inspired by the high specific reaction between tyrosine kinase and its covalent substrates, we immobilize the receptor onto silica gel with diverse sizes by only one step method. This offers us the new stationary phase with monolayered, homogenous and density controllable receptor. Comprehensive characterizations including electron microscopes are performed to realize the morphology, orientation, conformation and the retention activity of the immobilized receptors. On the foundation of depending relationship between injection amount and the retention time, we derive a new equation for receptor-drug analysis by the combination with the absorption energy distribution model. The effects of support size, the immobilizing method and the theoretical model on the determination of thermodynamic and dynamic methods are totally assessed to establish a new strategy for rapid analysis of ETA-drug interaction. This is potent to become an alternative for high throughput analysis of protein-drug interaction.

蛋白质-药物相互作用研究对于揭示药物体内作用机制和创新药物研发具有重要意义。项目组前期建立的受体色谱方法虽在受体-药物相互作用分析方面成功应用，仍面临药物用量大和分析时间长等亲和色谱共性问题。本项目拟以内皮素受体A（ETA）为对象，将表皮生长因子受体中酪氨酸激酶活性肽段重组至ETA碳末端，人髓性白血病细胞系表达获得重组受体；利用酪氨酸激酶活性肽段与其共价抑制剂依鲁替尼的特异性反应，一步法将ETA定向固载于不同粒径硅胶微球表面，制备单层均质密度可控的受体色谱固定相；扫描电镜、激光共聚焦显微镜和马西替坦等工具药表征其形貌、取向及构象和保留活性；依据溶质进样量和保留时间依赖关系，推导获得色谱新方程，结合吸附能量分布模型，测定受体-药物相互作用参数；系统评价担体尺寸、固定化方法和理论模型对上述参数的影响规律，建立ETA-药物相互作用快速分析色谱方法，为其他蛋白质-药物相互作用高通量分析提供借鉴。

蛋白质-药物相互作用研究对于揭示药物体内作用机制和创新药物研发具有重要意义。本项目针对受体色谱法研究受体-药物相互作用过程中药物用量大和分析时间长等问题，以内皮素受体A（ETA）为对象，将表皮生长因子受体中酪氨酸激酶活性肽段（EGFR）重组至ETA碳末端，大肠杆菌表达获得高活性重组受体，与His标签相比，EGFR标签具有分子伴侣样蛋白的特点，能有效提高可溶性受体的表达量；利用酪氨酸激酶活性肽段与其共价抑制剂依鲁替尼的特异性反应，一步法将ETA从细胞裂解液中定向固载于三种不同粒径硅胶微球表面，制备单层均质密度可控的受体色谱固定相；扫描电子显微镜、能谱分析和X射线光电子能谱分别表征固定相形貌和表面元素组成，提示ETA已成功固载于硅胶表面；马西替坦等工具药的色谱保留行为和放射性配体免疫法表征固定化ETA的配体识别活性；探讨了四种阳性药在不同粒径ETA色谱柱上的保留规律，证明5 μm粒径受体色谱固定相分析效果最佳；采用系统四步法，对ETA-药物相互作用进行了快速精准分析，建立了基于吸附能量分布（AED）的功能蛋白质-药物相互作用快速精准分析热力学模型；采用非线性色谱法、峰值轮廓法和峰值衰减法研究了ETA-药物相互作用动力学参数，建立了ETA-药物相互作用热力学快速分析方法；用所建立的ETA色谱模型筛选了四物汤中的活性成分，质谱法解析了四物汤中作用于ETAR的靶向成分为芍药苷与阿魏酸，AED与分子对接法研究了活性成分与受体的相互作用，离体血管环法证明了两种活性成分均能舒张由ET-1引起的大鼠胸主动脉收缩，提示ETA色谱能快速识别复杂体系中的靶向成分。上述研究系统评价了色谱担体尺寸、固定化方法和理论模型对ETA-药物相互参数的影响，建立了ETA-药物相互作用快速分析色谱方法，并将该方法应用于中药靶向活性成分筛选中，为其他功能蛋白质-药物相互作用高通量分析和复杂体系靶向成分快速筛选提供了借鉴。