适度水分胁迫促进甜菊RA苷合成关键基因SrUGT76G1表达的分子机制研究

Steviol glycosides (SGs) are tetracyclic diterpenoids derived from the leaves of Stevia rebaudiana Bertoni. Due to the high sweetness and low calorie, SGs have been widely used in food and medicine industry. Stevioside (St) and Rebaudioside A (RA) are the two main components of SGs. Compared with St, the sweetness of RA is closer to sucrose and it can be used for the synthesis of some trace glycosides in vitro. Therefore, how to increase the concentration of RA is one of the hottest topics in recent years. Previous studies showed that moderate water stress positively regulates the expression level of RA glycoside synthesis key gene SrUGT76G1. In addition, we also found two water stress responsive fragments in the promoter of SrUGT76G1, however, the specific response elements and their binding proteins remain unclear. Based on these findings, this project aims to further reveal the upstream regulatory protein and its mechanism under moderate water stress by physiological, biochemical and molecular biology methods. The results of this project not only identify important candidate genes for further increasing the RA glycoside content in new germplasms, but also provide a theoretical reference for the further study of efficient water use and management of stevia varieties in the future cultivation.

甜菊糖苷是从甜菊（Stevia rebaudiana Bertoni）叶片中提取的多种四环二萜类糖苷的总称，因其具有高甜度、低热量等特点，已被广泛应用于食品和医药等领域。St苷和RA苷是其中最主要成分，相比于St苷，RA苷甜度更高、口感更接近蔗糖，此外它还可作为体外合成其他微量糖苷的原料，因此如何提高RA苷含量一直是甜菊领域研究的热点之一。项目前期研究发现适度水分胁迫可以正向调控RA苷合成关键基因SrUGT76G1表达，进而促进RA苷合成，另外还发现SrUGT76G1启动子上存在两个水分胁迫显著诱导表达的区段，但具体的响应元件及其结合蛋白尚不明确。本项目拟在此基础上，进一步利用生理生化和分子生物学等手段揭示适度水分胁迫条件下SrUGT76G1的上游调控蛋白及其作用机制。该项目不仅为高RA苷含量新种质的创新培育提供优异候选基因，也为进一步研究甜菊生产栽培的高效水分利用与管理提供理论参考。

RA苷是甜菊叶片中富含的优质糖苷，具有高甜度、低热量等特点，因此被广泛应用于食品和医药等领域。项目前期研究发现适度水分胁迫可以正向调控RA苷合成关键基因SrUGT76G1的表达，进而促进RA苷合成，而其中的分子机制并不清楚。本研究在克隆SrUGT76G1启动子序列的基础上，进一步通过缺失构建及瞬时转化烟草并结合干旱处理发现了SrUGT76G1启动子最小的响应水分胁迫的元件为F5段（-250 ~ +50）MYBCORE元件。通过酵母单杂交手段筛选到了多个结合在SrUGT76G1启动子的反式作用因子，并对其中的一个MYB类转录因子SrMYB1进行了较为深入研究。SrMYB1 ORF全长1074 bp，编码357个氨基酸残基，是典型的R2R3类型MYB转录因子。对不同组织中SrMYB1的表达量进行分析发现，其在花中的表达量最高而叶片中的最低。转录激活活性实验发现SrMYB1具有转录激活活性并且主要定位在细胞核。酵母单杂交和EMSA实验证实，SrMYB1可以结合SrUGT76G1启动子上临近ATG的MYB元件。烟草瞬时表达及转化甜菊愈伤实验均发现，SrMYB1具有抑制SrUGT76G1表达的功能。水分胁迫响应模式分析发现，在水分胁迫的早期阶段，SrMYB1表达受抑制，而SrUGT76G1表达上调。综上所述，适度水分胁迫可能通过下调SrMYB1表达从而促进SrUGT76G1的转录最终达到提高RA苷合成的作用。