石斛碱单克隆抗体的制备及其ELISA检测方法的建立

石斛碱（dendrobine）是金钗石斛中主要的特征性与活性成分，为倍半萜类生物碱，常作为指标性成分用于药材的质量控制。由于其结构上不具有共轭多烯或π键体系，在紫外区基本无吸收峰，采用仪器分析方法进行含量测定和体内代谢研究具有较大的难度。基于抗原抗体特异性结合的原理，本项目利用杂交瘤技术制备能特异性识别石斛碱的单克隆抗体，建立一种简单有效、快速灵敏、专属性强的ELISA检测方法，对所建立的方法进行考察，应用于金钗石斛药材及其复方制剂中石斛碱的定性定量和体内药代动力学研究。本项目建立的方法能够制备成商业化的检测试剂盒，使得中药复杂体系及体内药物分析中微量成分的快速、批量测定成为可能，为抗体技术在中药及生物样品复杂体系中的研究提供理论基础和参考，为中药的质量评价及有效成分药代动力学的检测提供新的思路和方法。

石斛碱（dendrobine）是我国常用名贵中药金钗石斛（Dendrobium nobile Lindl.）的特征活性成分，为倍半萜类生物碱，常作为指标性成分用于药材的质量控制。由于其结构上不具有共轭多烯或π键体系，在紫外区基本无吸收峰，采用仪器分析方法进行含量测定和体内代谢研究具有较大的难度。.基于抗原抗体特异性结合的原理，本项目在对石斛碱进行结构改造的基础上，采用碳二亚胺法合成了石斛碱的人工抗原；经红外光谱法、荧光光谱法、SDS-PAGE法鉴定，人工免疫抗原DNC-BSA和包被抗原DNC-HSA、DNC-OVA合成成功，MALDI-TOF-MS法测定其偶联率分别为11，11和12，符合免疫的要求。利用杂交瘤技术制备特异性识别石斛碱的单克隆抗体，采用DNC-BSA免疫小鼠，间接ELISA法检测免疫小鼠效价达51 200以上，免疫效果良好；选择效价最高的小鼠，取脾细胞和骨髓瘤细胞sp2/0在PEG作用下进行融合，HAT和HT培养基筛选，经间接ELISA法检测细胞上清液，不同包被抗原筛选和细胞克隆化得到杂交瘤细胞株4E7-C5。采用腹水诱导法大量制备单克隆抗体MAb 4E7-C5，经分型鉴定该抗体为 IgG型。对间接竞争ELISA（ic ELISA）的检测条件进行了优化，结果表明，DNC-HSA作为包被抗原，最佳包被浓度为1 μg/mL，4℃过夜包被，封闭液为5%脱脂奶粉，封闭时间1.5小时，抗原抗体工作时间1小时，底物显色时间20分钟，甲醇作为竞争抗原石斛碱的溶解试剂且浓度低于10%时，所建立的间接竞争ELISA法最灵敏。对单克隆抗体的特性进行鉴定， MAb 4E7-C5效价达256 000，特异性识别石斛碱类生物碱，敏感性为9.0 μg/mL。将建立好的ic ELISA法进行方法学验证，线性方程y = -39.041x + 204.39，R² = 0.9904，检测范围9.0-1.0 μg/mL；加样回收率在95%-105%之间，批内和批间精密度RSD均小于5%，重复性RSD为2.649%。ic ELISA法和GC法相关性良好，R² = 0.992。.本研究首次将免疫学技术应用于金钗石斛的活性成分石斛碱的分析研究中，突破了传统仪器分析方法在检测该类化合物中的局限，为免疫分析技术应用于中药活性成分的检测提供理论基础和参考，为中药的质量控制提供新的思路和方法。.