自噬途径参与氧糖剥夺促进Aβ产生的分子机制的研究

缺血性卒中和老年痴呆（AD）是严重影响人类健康的中枢神经系统疾病，流行病调查表明卒中病人极易发展为痴呆。因而，这两种疾病的互相关联和交叉已成为目前国际该领域研究热点。自噬机制被认为在神经损伤和神经退行性疾病的病理过程中发挥重要作用。然而，自噬是否参与脑缺血损伤过程中促进AD的过程目前尚不清楚。本课题组前期结果表明动物脑缺血后认知功能下降；脑损伤、及痴呆相关蛋白表达增加，而且脑内自噬水平也有升高，提示自噬作用可能参与这个过程。为深入研究潜在的分子机制，在本项目中拟建立APP695/N2a细胞株氧糖剥夺的体外脑缺血模型，在此基础上给与调节自噬药物和/或神经保护药物（丁基苯肽）进行药物干预，检测自噬通路、Ａβ及其上游通路的活性，明确自噬、NBP对Aβ生成的影响及作用靶点。本项目预期取得的成果可深入人们对缺血性卒中促进老年痴呆的机制的认识，为研发新的防治途径和药物等提供基础。

缺血性中风和中风后痴呆都是当今社会中的常见病、多发病，缺血性中风往往与患者严重的认知功能障碍的产生有关。自噬与神经退行性病变、脑中风、肿瘤以及老化等很多疾病有密切的联系。自噬途径在神经变性疾病，尤其在缺血性中风和中风后痴呆中的作用是近年来研究热点。为探索缺血性中风后，调节自噬对神经细胞损伤及痴呆相关蛋白表达的影响及潜在机制，在本项目的研究中，我们对培养的APP695/N2a细胞株进行氧糖剥夺（ＯＧＤ），建立体外脑缺血模型，在此基础上给与工具药物autophagy inhibitor（3-MA）、autophagy activator （rapamycin）或丁基苯肽(n-butylphthalide，NBP)进行药物干预，通过ELISA、RT-PCR、蛋白免疫印迹、激光共聚焦显微镜等方法，检测神经细胞坏死和凋亡、蛋白表达的细胞共定位、自噬水平、Beta-淀粉样蛋白表达及其上游通路等指标的变化。我们研究发现，ＯＧＤ导致培养的APP695/N2a细胞株的细胞损伤和自噬过度激活，NF-κappa B信号通路活性增强，Beta-淀粉样蛋白生成增多。给与工具药物自噬抑制剂3-MA和神经保护药物NBP，减轻细胞损伤，增强细胞活力，NF-κappa B信号通路活性下降，降低生成Beta-淀粉样蛋白的关键酶beta- 和 gamma-分泌酶活性，减少Beta-淀粉样蛋白生成；而给与工具药物自噬激活剂rapamycin上调自噬，加剧细胞损伤，NF-κappa B信号通路活性增高，生成Beta-淀粉样蛋白的关键酶beta- 和 gamma-分泌酶活性增高，Beta-淀粉样蛋白生成增加。我们得出结论，抑制自噬的过度激活，影响NF-κappa B信号通路,增加与BACE1启动子相应位点的结合,从而抑制BACE1的转录和翻译,降低其对APP酶切的活性,最终减少Beta-淀粉样蛋白1-40和1-42生成。NBP在缺血性卒中的神经保护作用与下调自噬有关。自噬在神经损伤和神经退行性病变方面的研究具有很大的研究潜力，我们的研究将使我们深入认识缺血性中风促进认知障碍产生的机制，发现新的防治途径，具有重要的现实意义。