春石斛超低温保存中程序性细胞死亡信号分子及其传导途径研究

Protocorm-like bodies (PLBs) of Dendrobium nobile, from which 2 cryopreservation differential expression proteins related to apoptosis were identified, will be used as the material in our study. First, the programmed cell death (PCD) event, the contents of endogenous PCD inducers (including hydrogen peroxide, superoxide radical, nitric oxide and ethylene) and the effect of their inhibitors on PCD event and PLBs survival will be determined during the cryopreservation by vitrification to find out the PCD related signal molecules. Then, inhibitors of PCD related signal molecular and mitochondrial permeability transition pore will be used in protocal of PLBs cryopreservation by vitrification as additives, with the no added as control, while the characteristic index of PCD event and mitochondrial PCD pathway, the content of endogenous signals molecules and the expression of apoptosis-related protein will be measured. Last, the relationship between the signal molecules and mitochondrial PCD pathway and the apoptosis-related protein located in endoplasmic reticulum will be discussed. The aim is to explore the PCD related signal molecules and their regulation pathways during the cryopreservation.

以前期在超低温保存中鉴定出凋亡蛋白的春石斛类原球茎（PLBs）为实验材料，通过研究类原球茎玻璃化超低温保存中程序性细胞死亡（PCD）特征指标、PCD诱导物质（过氧化氢、超氧阴离子、一氧化氮、乙烯）内源含量变化及其抑制剂使用对PCD和存活率的影响，确定PCD内源信号分子；在此基础上，将PCD内源信号的抑制剂和线粒体通透性转换孔抑制剂分别导入玻璃化超低温保存程序，以未添加体系为对照，检测这些实验体系中PCD特征指标、线粒体PCD途径特征指标、信号分子内源含量和我们鉴定得到的定位在内质网的凋亡蛋白的表达变化，探讨信号分子和线粒体PCD途径及凋亡蛋白的关系，从而揭示超低温保存中PCD相关信号分子及其传导途径。

项目背景：超低温保存技术是目前长期保存种质的最有效方法，但一些物种超低温保存后出现存活率低或不能再生长的情况。动物和人类细胞及组织的超低温保存研究已经证实超低温诱导的程序性细胞死亡（PCD）是造成存活率下降的关键原因之一。但在植物超低温保存诱导的PCD研究还很少。为了探明植物超低温保存过程中PCD的发生情况以及诱发PCD 发生的信号分子和信号分子的传导途径，我们开展了该研究。.主要内容：本课题基于前期工作基础，以春石斛‘红梦幻’（Dendrobium nobile Lindl.‘Hamana Lake Dream’）类原球茎为材料，从植物逆境胁迫下常见的PCD发生信号分子入手，采用玻璃化超低温保存方法，研究了整个保存过程中指证PCD的指标、PCD发生的关键环节和信号分子的变化情况；基于以上结果，在PCD发生的关键环节导入信号分子调控剂，检测PCD发生情况极其对液氮冻存后类原球茎生活力和的影响，明确玻璃化超低温保存中诱导PCD发生的信号分子；同时导入信号分子调控剂的情况下，测定信号分子及其相关合成物质的变化情况，探PCD发生中信号分子间的关系及其可能传导途径。.重要结果：①信号分子活性氧（ROS）、一氧化氮（NO）以及乙烯（Eth）参与了春石斛类原球茎玻璃化超低温保存过程中PCD的发生，调控ROS、NO以及Eth，可使超低温保存后春石斛类原球茎细胞活力分别提高15.28%、17.78%、21.80%。②信号分子NO通过影响过氧化氢酶 (CAT) 和抗坏血酸-谷胱甘肽 (AsA-GSH) 循环系统与ROS相互作用，行使其信号功能，进而影响到超低温保存后类原球茎的存活率和PCD发生。③信号分子ROS和Eth在PCD发生过程中存在着双向互作关系；CAT 和AsA-GSH循环系统是Eth参与调节ROS的关键作用位点；ROS对Eth的调节主要是通过作用于乙烯前体（ACC）、ACC氧化酶（ACO）以及ACC合成酶。.科学意义：本研究从信号分子角度揭示了春石斛类原球茎超低温保存中PCD的发生机制，证实了通过调控信号分子可以延缓PCD的发生进程，从而提高超低温保存后春石斛类原球茎细胞活力。研究结果对揭示植物超低温保存机制和改进保存技术具有理论和实践意义。