抗冻干胁迫的保加利亚乳杆菌糖代谢关键biomarkers识别及其作用机制

Lactobacillus bulgricus, as an important strain of Direct Vat Set (DVS), was subjected to multiple stresses during freeze-drying, such as freeze, dry and osmotic pressure. This procedure could cause fall of metabolism ability or loss of acticity and energy, and bring about greater economic losses, therefore the aim of this study will clarify stress mechanism of tolerance to freeze-drying for lactic acid bacteria in order to solve technique bottleneack of freeze-drying and supply important theoretical basis. In the project, on the basis of the result, which freeze-drying survival rate of Lactobacillus bulgricus was obviously increased after NaCl stimulation, we will utilize HPLC, reverse transcription quantitative PCR, microarray and 2D-DIGE technique, and structure metabolic flux model of major products in glucose metabolism from Lactobacillus bulgricus, and confirm correlation between metabolic flow distribution of key products and freeze-drying survival rate of strains, and at the same time changes of pathway, key enzymes and related mRNA in glucose metabolism are also researched after NaCl stimulation in order to identify biomarkers (enzymes and mRNA) and analyse cross-protection mechanism by using bioinformatics and data library, these all results would bring the mechanism of tolerance to freeze-drying stress to light. This project is studied at the molecular level of key enzymes in glucose metabolism, its results would clarify mechanism of anti-freeze-dry of Lactobacillus bulgricus after salt stimulation, and provide technique supports for acquiring excellent strains greatly resisted to freeze-drying.

保加利亚乳杆菌做为直投发酵剂的重要菌株，冻干过程中受冷冻、干燥和渗透压等多重胁迫作用，致使代谢能力下降，活性和活力损失，造成巨大的经济损失，因此阐明其抗冻干胁迫机理，为解决制约乳酸菌冻干生产的技术瓶颈提供重要的理论基础。本项目基于保加利亚乳杆菌经氯化钠（盐）刺激后可明显提高抗冻干性能的结果，利用高效液相、反转录定量PCR、基因芯片和双向荧光差异凝胶电泳等技术，通过构建盐刺激后乳杆菌糖代谢主要产物的代谢通量模型，明确关键代谢产物流量分配与菌株冻干存活率的相关性；同时研究盐刺激下糖代谢路径改变和代谢关键酶的活性及相关基因转录水平变化，识别出具有抗冻干能力乳杆菌关键biomarkers（酶和mRNA），并利用生物信息学工具和相应数据库，分析biomarkers作用机制，共同揭示出菌株抗冻干胁迫机理。项目从糖代谢关键酶分子水平层次阐明乳杆菌抗冻干胁迫机理，为获得强抗冻干胁迫的乳杆菌株提供技术支持。

项目背景：优质乳酸菌发酵剂要求具有一定的活力和功能活性，冷冻干燥法是生产直投式乳酸菌发酵剂的主要技术，但乳酸菌在冻干过程中遭受着冷冻、干燥和高渗等多重胁迫影响，造成乳酸菌细胞膜损伤和破坏，代谢能力下降，丧失其活性，最终细胞死亡，导致发酵剂生产失败，这已经成为制约我国直投式乳酸菌发酵剂生产的重要瓶颈问题。.主要研究内容：本研究以保加利亚乳杆菌为研究对象。用高效液相色谱法对葡萄糖、有机酸、乙酰辅酶A以及胞内能量代谢变化进行了分析，顶空气相色谱法对乙醛进行测定，分光光度法和比色法对关键酶活性进行了分析。采用双向荧光差异凝胶电泳技术分析保加利亚乳杆菌在NaCl胁迫下差异蛋白的表达。.重要结果：经NaCl胁迫，保加利亚乳杆菌增加碳源葡萄糖的利用来适应外界环境，可能与提高冻干存活率有一定的关系；丙酮酸代谢途径碳流量的改变利于胞内Acetyl-CoA含量的增加，是提高冻干存活率的关键因素之一；乳酸脱氢酶活性的增加提高了保加利亚乳杆菌的活力，进而提高了其冻干存活率；与蛋白质合成、核苷酸合成和碳水化合物合成相关蛋白及应激蛋白的差异表达，利于细胞增强适应环境胁迫的能力。.关键数据：经NaCl胁迫，保加利亚乳杆菌对葡萄糖的利用率增加，代谢速率相对提高48.18%（P<0.01）。乳酸含量增加，生成速率相对提高8.93%（P<0.01），乙酸含量出现负增长，乙醛含量减少，生成速率相对降低了22.86%（P<0.05），Acetyl-CoA的含量约增加31.35%（P<0.01）。胞内ATP含量相对降低了28.8%（P<0.01），NADH/NAD+比率增加了7.4%（P<0.01）。乳酸脱氢酶活性相对增加2.29%（P<0.05），乙酸激酶活性相对增加2.45%（P<0.05），乙醛脱氢酶活性相对降低了9.58%（P<0.01），磷酸乙酰转移酶活性相对增加6.52%（P<0.01）。乙酸激酶、乙醛脱氢酶和磷酸乙酰转移酶的变化均利于胞内Acetyl-CoA含量的增加。对差异表达的蛋白进行了分析，表达上调的7个蛋白：与蛋白合成相关的3个蛋白，与核苷酸合成相关的1个蛋白，与碳水化合物合成相关的3个系统。表达下调的2个蛋白：与核苷酸合成相关的1个蛋白和未知功能的1个蛋白。.科学意义：该项目结果实现在分子水平调控乳酸菌的抗不良环境能力，为筛选和构建强抗不良环境的菌株提供理论依据和技术支持。