CcpA调控抗冻干胁迫保加利亚乳杆菌应激蛋白合成机制的研究

Lactic acid bacteria strain will result in loss of vitality and even cell death under freeze-dried process with osmotic pressure stress ,that is still the bottleneck for Chinese DVS industry. The preliminary project has clearly gived that anti-freezing dry stress capacity of Lactobacillus bulgaricus was significantly increased after stimulated by sodium chloride ,and at the same time , which key enzymes involved in glucose metabolic pathways of lactobacillus have a direct adjustment to anti-freeze-drying capcity,and the CcpA (catabolite control protein) is an important regulatory factor for sugar metabolic enzymes to enhance the anti-stress ability of Lactobacillus under freeze-drying.In this project, we will construct CcpA mutant strains by homologous pairs of exchange method, determine the metabolic components by HPLC method, analyze the key enzymes and the expression level of fluorescence two-dimensional difference gel electrophoresis and changes of enzyme by qRT-PCR technology. Combining with metabolic changes, the relevant protein activity, and gene transcription level results, clear intermediate and final metabolites. Research that anti-freeze-dry ability of Lactobacillus bulgricus was also preformed under oxygen control and salt stimulation. Bioinformatics tools and the corresponding database is used to analyze the result of the proteins and transcription, revealing the expression of key enzymes of glucose metabolism regulation mechanism based on CcpA to improve the anti freeze tolerance of Lactobacillus,in order to further clarify the anti-stress mechanism of lactic acid bacteria to provide theoretical support.

乳酸菌冻干过程中受多重胁迫作用导致菌株活力丧失、死亡仍是制约我国乳酸菌发酵剂生产的瓶颈。项目前期工作已明确经氯化钠刺激后的保加利亚乳杆菌抗冻干胁迫能力显著提高，提高糖代谢途径所涉及的关键酶(PFK,PYK，LDH)表达水平是其抗冻胁迫能力提升的重要因素，并发现CcpA是糖代谢酶及相关代谢重要调控因子。本项目采用同源双交换法构建的CcpA缺失株，通过HPLC法测定代谢组分，通过i-TRAQ技术和qRT-PCR分析糖代谢关键酶、盐应激蛋白的变化及相关基因表达水平，结合相关蛋白活性和基因转录水平数据，明确代谢物差异；同时比对研究控氧和盐刺激协同作用下以上代谢变化对乳杆菌抗冻干能力的影响，利用生物信息学和相应数据库对蛋白和转录结果进行分析，结合CcpA-cre位点相互作用研究，共同揭示出基于CcpA调控糖代谢关键酶表达来提高乳杆菌抗冻干胁迫能力的机制，为进一步明确乳酸菌抗胁迫的机制提供理论支持。

项目背景：保加利亚乳杆菌作为重要的工业化菌株，在使用过程中受到多重环境胁迫，严重影响了菌株的发酵性能，造成了巨大的经济损失。因此明确其面对胁迫时的应激反应机制，对于解决制约乳酸菌发酵剂的生产技术瓶颈和提高菌株利用率有着重要意义。.主要研究内容：利用前期构建的保加利亚乳杆菌CcpA缺失株，以CcpA功能研究为切入点，通过分析突变株和亲本株在氧控制和盐刺激下的生长、代谢通量、关键酶活性、抗逆性等指标，借助蛋白组学和转录组学技术分析相关蛋白和基因表达水平变化。.重要结果：从代谢表型、蛋白层面和基因水平首次阐明了CcpA是保加利亚乳杆菌糖酵解途径关键酶调控的总因子，对pfk-pyk操纵子具有正向调控作用；多种应激蛋白和诱导因子的差异表达解释了菌体面对胁迫的应答机制，CcpA对提高菌体耐热性和耐冷性的蛋白有正向激活作用，而对参与氧胁迫的一些蛋白有逆向遏制作用；有关碳水化合物和氨基酸的转运与代谢，脂肪酸的合成，蛋白质合成以及遗传信息表达等多种生理过程的蛋白差异表达，证明了CcpA具有多效调控作用。.关键数据：CcpA缺失后，菌体的生长代谢受到显著影响。与亲本株相比，突变株菌体密度减少了23.08%，葡萄糖消耗速率降低了15.30%，乳酸生成速率降低了47.62%，乙酸生成速率增加了47.73%，胞内磷酸果糖激酶(Pfk)的活力下降了88.16%，丙酮酸激酶(Pyk)的活力下降了82.81%，乳酸脱氢酶(Ldh)的活力降低了73.14%；同时Pfk，Pyk和Ldh的蛋白表达水平分别降低了0.44、0.51和0.44倍，对应的编码基因在转录水平上的表达也显著下调。CcpA缺失后，菌体的耐热性下降，菌体密度是亲本株的3.14%。在冷胁迫中的菌体密度仅是亲本株的48.42%，而CcpA突变株的抗氧化性提高了32.25%。对差异蛋白进行了分析，其中表达呈现上调的蛋白为58个，下调的蛋白为74个。.科学意义：该项目结果首次揭示了CcpA调控保加利亚乳杆菌糖代谢关键酶与应激蛋白机制，为进一步明确乳酸菌的抗胁迫机理提供理论参考，同时也为高耐受性乳酸菌的开发提供技术支持。