微生物合成萜烯化合物过程中的跨膜转运与代谢传质强化

Synthetic biology has been widely applied to the design and modifications of microbial cell factories, which highly facilitates the development and applications of biological manufacturing. More and more plant terpenoids have been produced by microorganisms. However, the applications of microbial manufacturing have been seriously limited by the heterogeneous multiple membrane system of microbes, resulting in difficulties in transmembrane transport of endogenous metabolites and low efficiencies of products extracellular secretions. Therefore, in this project we use glycyrrhetinic acid and oleanolic acid, two economically important pharmaceutical pentacyclic triterpenoid, as the model product of pentacyclic triterpenoid and yeast as the chassis, in order to construct protein library of pentacyclic triterpenoid transporters. First of all, not only the structures of typical transporters but also their mechanisms to identify, transport and release pentacyclic triterpenoid will be analyzed and obtained. Secondly, the dynamic mechanics of transporters as well as its relationships with transmembrane transport flux will be illuminated. Thirdly, the regulation methods for positioning and quantitative expression of transporters will be established and the transmembrane transport flux of pentacyclic triterpenoid as well as its intermediate metabolites will be improved. Furthermore, the efficiencies of metabolites synthesis and their transmembrane transport will be enhanced by optimization and modification of transporters so that the highly efficient microbial synthesis of pentacyclic triterpenoid will be established. The study will not only be useful to provide new thoughts for prediction, design and modification of transporters with high efficiency to transport pentacyclic triterpenoid, but also provide new strategies to enhance high level microbial manufacturing.

利用合成生物学设计和改造微生物细胞工厂极大地促进了生物制造的发展，使越来越多的植物源萜烯化合物被微生物合成出来。但微生物的异源多膜系统导致胞内物质跨膜传递难、产物分泌效率低等普遍问题，严重地影响了微生物的制造水平。为此，本项目以酵母细胞合成甘草次酸和熊果酸为体系，挖掘并构建转运植物五环三萜化合物及主要中间体的蛋白质数据库，拟解决以下科学问题：1）解析其典型转运蛋白的结构及其识别、传递与释放五环三萜化合物的结构转换机制；2）阐明驱动转运蛋白的动力学机制与跨膜转运通量的关系；3）研究转运蛋白的定位与定量表达调控如何平衡五环三萜化合物及其中间代谢物的合成与传质，提高其跨膜转运通量。在此基础上，通过优化设计并改造转运蛋白，强化跨膜传递与代谢物的合成速率，实现微生物高效合成五环三萜化合物。项目研究将为预测、设计和改造高效转运萜烯化合物的蛋白质提供新思路，也为高水平微生物合成的强化方法提供新策略。

微生物细胞工厂合成植物天然产物过程中存在传质慢、合成效率低等问题，严重影响了该方法的推广与应用。为此，本项目以酿酒酵母合成植物天然产物香树脂醇和甘草次酸等五环三萜化合物为对象，研究合成途径中代谢物的胞内传质与跨膜传递机制，以强化其合成效率、提高产物的产量。主要研究成果如下：1）主动加速代谢前体物胞内传质：通过引入哺乳动物来源的上清蛋白因子（SPF）增加了中间代谢前体物鲨烯和2，3-氧化鲨烯的传质，β-香树脂醇的产量提高了423倍，强化了中间反应过程和效率；2）设计反应过程偶联促传质：依据代谢前体物的亲疏水性重设计反应模块，设计无膜细胞器实现了法尼烯焦磷酸等亲水性物质合成的偶联定位，利用脂滴偶联定位了从鲨烯到甘草次酸等疏水化合物的合成模块，缩短了代谢前体物传质距离，甘草次酸产量提高了2.8倍；3）强化目标产物主动外排：完成了乌拉尔甘草、胀果甘草和光果甘草的基因组测序和转录组数据库的构建；从甘草转录组和酿酒酵母中挖掘到了一系列与五环三萜化合物转运相关的候选转运蛋白，其中MATE蛋白38C对五环三萜化合物有转运功能；构建了（内）膜调控介导的产物外排方法，甘草次酸产量提高了67.9%； 4）糖基化结构伪装出胞：糖基化后修饰可改变目标化合物亲疏水和结构特性，建立了糖基修饰提高五环三萜化合物胞外转运能力的方法，通过对甘草次酸C3位引入糖基，其胞外转运能力提高了15.4%，产量提高了3.88倍；5）设计特异性萃取过程拖拽出胞：依据目标化合物的结构与亲疏水性寻找和设计可特异性抓捕细胞膜中目标产物的聚合物分子，通过表面展示技术实现酿酒酵母原位合成环糊精，有效抓捕了β-香树脂醇，促进其外排，结合两相发酵技术，使β-香树脂醇的胞外产量提高了35倍。形成了一套开发微生物细胞工厂高效传质与转运的设计准则。以上研究结果在ACS Catalysis、Metab Eng、Biotech Bioeng、ACS Synth Biol等期刊发表论文51篇，其中SCI论文38篇；申请国家发明专利7件、已授权4件；培养博士研究生6人，硕士研究生8人，博士后3人；培养青年骨干教师4人（1人获万人领军人才计划，1人获中国科协青年人才托举计划，1人获北京市科技新星，1人晋升正教授）。项目执行期间还主编了我国首部《合成生物学》教材。