基于精密肝切片技术的何首乌致肝毒性物质基础研究

Recently, the hepatotoxicity of Radix polygoni multiflori (RPM) is often reported, but its toxic substance basis is still unknown and there is less agreement when its toxic material are discussed. Previous study showed that large dosages of raw RPM water extract had obvious liver toxicity on rats, and the inhibitory effect on HepG2 cell of four trace constituents from RPM methanol extract were stronger than that of emodin. So we put forward the hypothesis: "RPM contains more hepatototxic ingredients, other than the common anthraquinones". Precision-cut liver slice technique is one of the new ideal technologies currently used in the research of traditional Chinese medicine liver injury, with the characteristics of simple, fast, economic and high sensitivity, which can determine liver injury in lower dose and shorter time. Therefore, we intend to isolate and identify the toxic constituents from RPM by using the toxicity-guided separation strategy, and study their toxic mechanism by measuring the expression of CYP450 in liver slice. The ultimate aim of this research is to elucidate the hepatotoxic constituents of RPM and their toxic mechanism. The research results will provide the basis for the rational use of RPM.

近年来何首乌的肝毒性报道屡见不鲜，已成为社会关注的焦点，但其毒性物质基础却至今众说纷纭，莫衷一是。前期研究发现生何首乌给药大鼠有明显肝毒性，而且从其甲醇提取物中分离得到的4个微量成分对HepG2 细胞的抑制作用均较大黄素强。据此我们提出假说：何首乌的肝毒性成分“另有其人”，而非仅仅传统认为的蒽醌类成分。精密肝切片技术是是目前研究中药肝毒损伤的新型理想技术之一，具有简单、快速、经济、灵敏度高的特点，在更低的剂量、更短的时间即能测定出一定的肝损伤。因此，本课题拟严格执行肝毒性追踪分离策略，采用多种色谱和光谱技术对何首乌肝毒性成分进行分离鉴定，并通过测定肝切片中CYP450酶的表达，探讨其作用机制，最终实现阐明何首乌肝毒性物质基础和作用机制的目的。研究结果将为何首乌的合理利用提供依据。

何首乌作为经典补益药物，在临床和日常生活中广泛使用，年消费量在5000吨以上。近年来有关何首乌肝毒性的报道给中药再次蒙上雾霾，严重影响到中医药的名誉。到底是何首乌自身的毒性？还是储藏保管不当产生的毒性呢？分析所有不良反应报道，发现何首乌的肝毒性发生率很低，大概在1/20万。若蒽醌致毒，为何药食两用的决明子等（蒽醌含量大致相同）的肝毒性却没有？何首乌的“毒”到底来源于何处？在研究过程中，我们发现何首乌极易发霉，我们迅速抓住该点有了下列思考：发霉是个案还是普遍存在的呢？有哪些毒素？哪些毒素最高？这些毒素与肝毒性的关系如何？与产地加工的关系如何？如何消除这一可能的染毒环节？本文首先采用HepG2 细胞和大鼠肝切片评价了何首乌中11个蒽醌类化合物的肝毒性。结果发现若要导致肝毒性，需要至少单次口服339克的何首乌，这显然是不合常理的。因此，我们迅速把研究转向何首乌发霉这个事件上。采用UPLC-MS/MS技术建立了同步测定何首乌中12种真菌毒素的方法，对41批何首乌样品（36批生首乌，6批制首乌）进行了检测。结果发现15批样品被污染，共检出8种毒素（FB1、FB2、AFB1、AFG2、OTA、OTB、HT-2和T-2），含量分布在1.09~1643.2 μg·kg-1间。其中一份生首乌中FB2超标（1643.2 μg·kg-1），一份制首乌中AFB1超标（6.8 μg·kg-1）。此外，尚有其他可能导致肝损伤的真菌毒素未被检测，其在何首乌中的污染水平不得而知。据此，我们认为何首乌发霉产生的真菌毒素是导致其肝毒性的物质基础。高含水量和高温是致何首乌发生霉变的两个重要因素。为从根源上杜绝何首乌的霉变，本文优选了何首乌的产地加工一体化方式，即：新鲜何首乌，快速洗涤，略晾，切去两端，趁鲜切制成8mm-12 mm 的厚片或者1cm3左右的厚块 ，80℃烘干12小时，即得。本文证实是外源性污染而非何首乌本身化学成分导致了何首乌的肝毒性，还了何首乌一个清白;同时还优选确定了何首乌产地加工一体化方法，为保证何首乌质量提供了依据。