保加利亚乳杆菌代谢含硫氨基酸关键酶基因差异分析及调控机制

Proteolysis of lactic acid bacteria for casein is the most important biochemical pathway leading to formation of sulfur-containing flavour composition, and sulfur-containing amino acid is the most component of flavour composition in fermentation dairy products. Those regulated lactic acid bacteria on physiological metabolism would have been improved the flavor and quality of fermented dairy products, which can not only satisfy consumption demands from people, but also reinforce the competitive on industry of culture in our country However, to data, gene diversity and molecule mechanism of key enzymes related to sulfur-containing flavour composition is not still clear after lactic acid bacteria hydrolyze casein. In this project, comparative genomics is used to study bioformation diversity of cell-wall bound proteinase, peptides transport, peptidases and amino acids degradation enzymes from Lactobacilli bulgaricus and Streptococcus thermophilus, which genomes have been fully sequenced. Caseins proteolytic system, key enzymes of sulfur-containing amino acid degradation pathways is compared, annotations of these genes have been improved by information data library and transcriptional analysis and relevant putative software, the above results and compared results of orthology and gene context together are used to analyse and clarify regulatory mechanism of key enzymes related to sulfur-containing flavour composition in Lactobacilli bulgaricus and Streptococcus thermophilus. Horizontal gene transfer events related to genetic level between flavour-forming and exopolysaccharide-producing is assumed and analysed in co-culture fermentation dairy products in order to predict and clear relation of between flavour-forming pathways and others metabolic products by predict horizontally transferred genes in both bacterial genomes.

乳酸菌水解酪蛋白形成含硫氨基酸是发酵乳的重要风味组成成分。调控乳酸菌生理代谢改善发酵乳制品的风味和质地不仅能够满足人们消费需求，更是提高我国发酵剂产业竞争力的重要手段。但目前对乳酸菌发酵中参与酪蛋白水解，含硫氨基酸代谢，并生成风味物质的相关酶基因差异和分子机理研究不十分清楚。本课题通过比较已知全基因组序列的保加利亚乳杆菌细胞壁蛋白酶、寡肽转移系统、细胞内肽酶和含硫氨基酸降解酶的生物信息学差异；通过生物信息学数据库、转录分析和相应的预测软件，重点地对含硫氨基酸降解路径相关酶进行分析比对、新功能注释，并修饰完善；研究结果结合直系同源鉴定和基因环境比较结果，分析并阐明含硫风味形成相关酶在保加利亚乳杆菌中的调控机制；并分析保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌在共发酵过程中，含硫风味物质和胞外多糖合成相关基因关系，明晰两株菌在长期共进化过程中，含硫风味物质形成路径和其他代谢产物之间的关联。

项目的背景：含硫风味物质是发酵乳的重要风味组成部分，乳酸菌水解酪蛋白是形成含硫风味物质主要的生化路径。但目前对参加乳酸菌水解酪蛋白，并生成含硫风味物质路径相关酶基因差异和分子机理研究仍不十分清楚。.主要研究内容：本项目研究保加利亚乳杆菌水解酪蛋白最佳条件，并对水解产物和相关酶活性进行研究；研究嗜热链球菌降解L-蛋氨酸过程中关键酶活性、含硫风味物质的产生、以及菌株的生长情况、产酸曲线和氨基酸消耗情况、L-蛋氨酸降解阶段的转录组全局性分析、L-蛋氨酸浓度对相关基因的表达及对其它代谢路径的影响；分析保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌在共发酵过程中，含硫风味物质形成路径和其他代谢产物之间的关联。.重要结果：保加利亚乳杆菌对酪蛋白的水解能力与其CEPs的活性相关，酶的活性越强其水解能力越强。水解过程主要是对酪蛋白进行降解，产生小分子的多肽和氨基酸。嗜热链球菌作为发酵乳生产的发酵剂菌株，在后熟过程中可以形成丰富的风味，添加高浓度L-蛋氨酸可刺激该菌株的生长，并有效提高菌株的产酸能力。添加2.0 g/L的L-蛋氨酸不仅能通过促进丙酮酸激酶的表达，从而提高嗜热链球菌的产酸速率，还能促进其“一碳单位”的代谢，同时，加快对酪蛋白水解产物向胞内的运输。共发酵明显提高含硫氨基酸和风味物质形成。.关键数据：保加利亚乳杆菌水解度为13.89%，多肽含量为0.63mg/mL，比活力为5.17U/mL。嗜热链球菌发酵L-蛋氨酸，24 h时产生甲硫醇，48 h时有二甲基二硫产生，酸化速率显著加快，氨基酸消耗量较大的是脯氨酸、天冬氨酸、亮氨酸 (>0.3 g/L)。通过Illumina Hiseq2000平台测序，总计产出4,792,971,600 nt数据。所有注释上的Unigene是2,487个。发现SSR 28个，其中，三核苷酸重复次数最高，达46.4%。232个差异表达的基因中有151个基因参与了73个不同的代谢或信号通路，并发生上调或下调。混合菌种的水解度最高达到15.03±1.02%，48h同时产生甲硫醇和二甲基二硫，共发酵菌种相互作用时加大了蛋白质的水解量，提高了氨基酸的浓度，丝氨酸，谷氨酸，胱氨酸，酪氨酸变化较为显著。.科学意义：澄清乳酸菌在基因和分子水平上风味合成路径关键酶的变化，更好地利用嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的共发酵特性，获得能够改善发酵乳风味和质地的菌株和技术。