基于线粒体差异蛋白质组学结合脑微透析研究栀子不同饮片抗脑缺血的药效物质及作用机制差异

There are some differences between different processed products of Gardenia jasminoides Ellis(GF) including crude, stir baked into brown and fried into carbon which improve mitochondrial respiration function. However, their effective substance basis and molecular mechanism are still unclear. Based on this, different crude and processed products of GF will be administrated on the MCAO rats. To gain insights upon the effect of stir-baked processing on the pharmacological changes of GF, the mitochondrial respiration function and amino acids neurotransmitter of cerebral cortex of MCAO rats will be detected by iTRAQ labeling proteomics combined with microdialysis technique. The difference in efficacy of pharmacodynamic substance in terms of protection against ischemia of processed GF will be revealed combined with the difference in chemical composition of the processed GF. The mechanism of the processed GF protection against MCAO cerebral ischemia rat will also be confirmed by proteomics tools. Moreover, the processing mechanism of processed GF will be further clarified. In brief, this study will provide a strategy to investigate the property and processing mechanism of the Chinese medicine and its processed products by mitochondrial proteomics and brain microdialysis.

栀子不同饮片（生栀子、焦栀子、栀子炭）对改善脑缺血MCAO大鼠的线粒体呼吸功能作用具有差异性，但其药效物质及作用机制尚不明确。大脑皮层是脑缺血易损伤主要部位之一。基于此，本课题拟以临床常用栀子饮片为研究对象，以皮层为靶点，采用脑微透析技术动态取样，建立液质联用多反应监测方法检测MCAO大鼠皮层透析液氨基酸类递质的含量和不同饮片主要化学成分的动态分布差异，结合整体性体外化学成分差异分析，运用多元变量相关分析，明确栀子不同饮片抗脑缺血药效物质差异；采用 iTRAQ标记线粒体差异蛋白质组和生物信息学技术，比较不同饮片对鼠脑缺血皮层线粒体蛋白表达差异，探讨其可能信号通路，揭示栀子不同饮片抗脑缺血作用机制差异。本课题从分子层面阐释栀子饮片的炮制机理，同时从与能量代谢相关蛋白表达差异性探讨栀子不同饮片药性变化规律，这将为中药饮片药性表征提供可借鉴的研究思路，同时也对同类中药炮制机理的研究提供有益参考。

课题组前期研究发现栀子不同饮片（栀子生品、焦品和炭品）对MCAO大鼠鼠脑线粒体呼吸功能具有差异性。基于此，本项目构建MCAO大鼠模型，研究栀子饮片对MCAO大鼠脑缺血药效及其作用机制的差异，通过行为学评分、TTC染色、ROS水平、Na+-K+ ATPase和Ca2+-Mg2+ ATPase指标变化，发现三种饮片存在药效差异，采用微透析技术，应用HPLC-MRM-MS/MS方法检测了三种饮片抗MCAO大鼠皮层兴奋性氨基酸和主要活性成分含量的变化，发现三种饮片对天冬氨酸和谷氨酸的释放有一定的抑制作用，抑制能力为生栀子＞焦栀子＞栀子炭，结果表明生栀子对脑缺血的保护作用最强；还首次发现脑缺血鼠脑皮层中臧红花酸的含量最高，其次为羟异栀子苷、京尼平-1-O-β-D-龙胆二糖苷和京尼平苷。生栀子组的成分含量最高，其次为焦栀子和栀子炭。这也和体外成分的结果一致。.采用iTRAQ定量组学方法，鉴定线粒体差异蛋白57个，其中上调13个，下调44个，生栀子给药后逆转上调蛋白5个，下调34个，焦栀子给药后逆转上调蛋白5个，下调32个，栀子炭给药后逆转上调蛋白3个，下调16个。即生栀子逆转的效果最强，栀子炭最弱。.三种饮片抗脑缺血的作用机制存在差异性，生栀子主要通过调节半乳糖代谢、淀粉和蔗糖代谢等6条通路发挥作用，焦栀子主要通过调节鞘脂代谢、氮代谢等7条通路，栀子炭主要通过Wnt信号通路等6条通路发挥作用。.此外，还从线粒体呼吸链角度初步探明三种饮片改善线粒体呼吸功能差异的原因在于调节氧化磷酸化通路相关蛋白表达能力有所差异，生栀子给药后cox7c(0.83)和cox7a2(0.82)仍为表达下调。焦栀子给药后cox4i1(0.83)仍为表达下调；栀子炭给药后cox7c(0.73),atp5o(0.75),cox4i1(0.77),cox7a2(0.78),ndufa4(0.78),cox6c(0.80)和ndufa1(0.82)7种蛋白仍表达下调。这几种蛋白的表达也可表征三种饮片的药性差异。.采用网络药理学方法，结合组学结果，构建了成分-靶点-通路作用网络，进一步发现栀子苷、西红花苷I、(-)-隐绿原酸、藏红花苦素等可能通过TNF-α，CASP8，CASP3等关键靶点发挥抗脑缺血损伤的作用。该项目初步明确了栀子不同饮片抗脑缺血作用的药效物质及作用机制差异，为阐明栀子饮片炮制机理提供依据。