杆状病毒诱导宿主细胞Arp2/3复合体发生核转运的机制研究

Arp2/3 complex is the primary actin polymerization branching factor. With the discovery of the nuclear actin polymerization, more and more attention has been paid to the Arp2/3 complex nuclear translocation mechanism and nuclear function. One of the unique features of baculovirus infecting insect cell is the nuclear actin polymerization and the Arp2/3 complex nuclear translocation, which provides an elegant cell model for the research of Arp2/3 complex nuclear translocation mechanism and function. To reveal which viral genes are responsible for the Arp2/3 complex nuclear translocation, a transient expression library of AcMNPV ORFs was constructed to screen candidate viral genes that mediate the nuclear relocation of Arp2/3 complex. By co-expression of each viral gene product and Arp2/3 complex in insect cells, we found Ac34 can mediate the nuclear relocation of Arp2/3-P40 subunit. We will continue to explore the effect of Ac34 on other Arp2/3 complex subunits and detailed molecular mechanism of Ac34 nuclear relocation of Arp2/3 complex. Our research will not only extend our understanding of baculovirus-induced actin polymerization, but also shed light on the function of the nuclear Arp2/3 complex.

Arp2/3复合体是引起细胞肌动蛋白聚合的主要效应分子。近年来随着细胞核内肌动蛋白聚合现象的发现，Arp2/3复合体的核转运机制与核内功能愈发引起重视。杆状病毒感染会引起昆虫宿主细胞Arp2/3复合体发生核转运并导致核内肌动蛋白聚合，以辅助新生病毒颗粒的装配。该特点使杆状病毒感染体系成为研究Arp2/3复合体核转运机制与核内功能的理想细胞模型。通过构建杆状病毒基因瞬时表达文库并逐一检测病毒基因对Arp2/3复合体亚细胞定位的影响，我们发现病毒晚期基因Ac34可以诱导昆虫细胞Arp2/3-P40亚基发生核转运。本课题将在此基础上继续验证Ac34对Arp2/3复合体其他亚基的作用，并探索Ac34诱导Arp2/3复合体发生核转运的分子机制。我们的研究不仅有助于深入理解杆状病毒诱导肌动蛋白聚合的分子机制，更加在细胞生物学层面为探索核内肌动蛋白聚合以及Arp2/3复合体核转运机制与核内功能打下基础。

苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）在感染宿主细胞的过程中，会将原本定位于胞质内的肌动蛋白聚合元件转移至胞核，从而在核内形成肌动蛋白聚合，为新生病毒颗粒的组装与运输提供服务。Arp2/3复合体是引起肌动蛋白聚合的效应分子，在AcMNPV感染过程中，与其他肌动蛋白聚合元件一起被转移到核内。研究Arp2/3复合体核转移的机制对了解病毒如何调控细胞肌动蛋白骨架系统具有重要意义。..在本研究中，我们通过构建AcMNPV的ORF表达文库，逐一筛选了所有病毒基因对Arp2/3-P40亚基的亚细胞定位影响。研究结果提示，病毒晚期基因Ac34单独表达即可引起原本定位于胞质内的P40发生明显的核转移。进一步研究发现，Ac34对于Arp2/3复合体其他亚基，包括P20, Arp2, P34, P21均有相同作用；而且在病毒基因组上敲除ac34后，病毒即丧失核转运Arp2/3复合体的功能。这些现象提示，AcMNPV感染过程中，通过其编码的Ac34蛋白在病毒感染晚期将胞质内的Arp2/3复合体转移到胞核。..为了揭示Ac34诱导Arp2/3复合体发生核转运的分子机制，我们首先分析了P40亚基在静息状态下定位于胞质的原因。结果发现，当在细胞培养基中加入LMB，一种抑制CRM1出核转运通路的药物，即可以引起P40重新分布到核内。这种现象提示，P40可能含有一段出核序列，从而通过CRM1依赖的通路不断由胞核转移到胞质，进而达到静息状态下呈现胞质内分布的状态。根据该设想，我们推测Ac34有可能发挥类似LMB的功能，将P40依赖CRM1的出核通路阻塞，从而将原本应该回流到胞质的P40滞留在胞核内。为了验证我们的设想，我们将一段经典的出核信号（NES）融合到EGFP上（EGFP-NES）。然后将EGFP-NES分别与mCherry或mCherry-Ac34共表达。结果发现Ac34可以成功地将原本定位与胞质的EGFP-NES转移到胞核，提示Ac34的确可以阻滞依赖CRM1的蛋白质出核转运。同时我们也在ac34敲除的病毒上验证了该现象，证明AcMNPV是通过Ac34抑制CRM1依赖的蛋白质出核转运，从而将Arp2/3复合体滞留在胞核内，进而参与胞核内的肌动蛋白聚合过程。