脑卒中Cofilin rod生成导致缺血半暗带神经元功能损伤的机制及其干预靶点研究

Cognitive dysfunction is one of the long-term complications in majority patients suffer with ischemic stroke, and neuron protection after ischemic stroke is important for the functional recovery in clinic. However, the mechanisms underlying the functional damage of the survival neurons after the ischemic stroke remain unclear. Cofilin, a cytoskeletal actin modulator, could form rod structure along with the actin (called cofilin rod) under certain abnormal condition such as glutamate excitotoxic stimulation. Long has been known that ischemic stroke induces large amount of glutamate accumulation in brain regions. Our previous studies have demonstrated that cofilin rods are formed in dendritic area under glutamate stimulation, and then they block intracellular trafficking and induce loss of synapse and impairment of synaptic function. Therefore, we hypothesis that excitotoxic glutamate stimulation during ischemic stroke induces cofilin to form rod structures which in turn triggering the loss of synapse and the impairment of synaptic transmission and plasticity, and further affect the cognitive function. By applying immunohistochmistry and electrophysiological techniques in MCAO rat model and ODG cell model, we tend to reveal: 1) whether ischemic stroke will trigger the cofilin to form rods in ischemic brain region, and their distribution pattern, 2) what is the molecular bases of the cofilin to form the rod structure, 3) whether the ischemic stimulation induced cofilin rods causes synaptic dysfunction of the neurons within the affected brain region and its underline mechanism, 4) what is the modulatory role of LIMK-SSH on the cofilin function and the rod formation under ischemic stimulation, and the possible role of LIMK-SSH-cofilin pathway in intervention of the neuronal damage after ischeminc stroke. From this study, we try to reveal a new mechanism underline ischemic stroke related neuronal damage and consequently cognitive dysfunction and provide new theory for neuron protection after ischemic stroke.

缺血半暗带神经元保护是缺血性脑卒中患者预后的重要措施，但缺血再灌注对神经元的形态功能损伤机制目前仍不清楚。我们前期发现肌动蛋白调控蛋白cofilin异常形成栓状结构（rod）后，阻碍胞浆运输，引起神经元突触丢失和功能受损，而谷氨酸兴奋毒性是导致Rod形成的重要诱因之一。虽然缺血性脑卒中后的早期病理变化包括谷氨酸的大量释放，但是否引起rod生成及其在神经元功能损伤中的作用至今没有研究报道。本项目拟在大鼠中动脉栓塞再灌注和培养神经元糖氧剥夺模型上，阐述缺血再灌注后1）脑内Rod形成的时空分布规律，2）rod生成的分子位点异常机制及其调控，3）缺血诱导形成rod损伤神经元形态功能的作用机制，4）Cofilin调控蛋白LIMK-SSH干预rod生成对缺血后神经元功能保护的作用及机制。项目完成将阐明Cofilin功能异常与缺血性脑卒中后神经元功能损伤关系的新机制，为保护神经元功能提供有效干预新途径

脑卒中是全世界第二大疾病死因和主要的致残病因之一。Cofilin作为细胞内肌动蛋白调控蛋白，对神经元树突伸展、突触形成以及树突棘的结构稳定都起到了重要作用。我们与其他人的先前研究发现ATP耗竭、过量谷氨酸处理等均会在培养神经元中引起cofilin-actin异常聚集形成 rod结构，影响突触形态与功能。由此我们在本项目中着重研究了大脑中动脉缺血再灌注（MCAO-R）是否导致cofilin rod产生及其干预机制。.本项目研究首次发现了cofilin rod在MCAO-R大鼠缺血侧皮层神经元树突中大量形成，并在缺血半暗区内分布最为密集；而缺血半暗区内cofilin rod的密度变化与突触前蛋白SV2A的信号强度变化成反比，证明脑缺血过程中cofilin rod形成会造成神经元突触结构的损伤。进一步应用免疫荧光、活细胞成像和全细胞膜片钳技术，在离体培养神经元中发现cofilin rod是通过造成微管网络的破坏，引起包括线粒体在内的细胞器运输停滞,从而导致神经元突触结构（树突棘）以及突触传递（mEPSC）的减弱。而通过药物刺激cofilin的激酶LIMK上游Rho以及抑制Rock活性上调LIMK的活性，或过表达LIMK1，或者都显著抑制了ATP耗竭导致的rod形成并逆转了神经元突触形态与功能的损伤。同样，在MCAO-R整体动物模型中，运用病毒载体过表达LIMK1也阻止了缺血缺氧导致的cofilin rod形成并挽救了神经元突触的丢失。.最后我们在本项目中开展了针对干预cofilin rod形成保护缺血缺氧对神经元结构功能影响的研究。我们发现NMDA受体拮抗剂美金刚与维生素C不但可以在培养神经元糖氧剥夺模型中抑制cofilin rod的形成，还可以抑制MCAO-R处理后大鼠缺血侧半暗区中的cofilin rod的形成并对树突微管结构起到保护作用进而保护神经元的结构与功能不被损伤；美金刚也可以通过抑制calpain的过度兴奋介导的caspase3蛋白相关神经元凋亡，逆转神经元在MCAO-R中的丢失。.本项目研究首次在缺血性卒中模型脑中阐述了cofilin rod的形成过程、形成机制、及其对神经元功能的影响，并进一步探讨了可能的干预手段。由此我们的研究揭示了缺血性卒中导致神经元损伤的一个新的可能机制，并为今后缺血性卒中后神经元功能保护提供了新的潜在治疗靶点。