脊髓背角AMPA受体在术后疼痛中的功能调节机制及细胞通透性小分子肽的干预研究

目前研究发现AMPA受体拮抗剂有很强的术后镇痛效应，但其副作用妨碍了临床应用。研究证实，兴奋性突触后膜AMPA受体GluR1/GluR2亚基组分变化影响该受体对Ca2+的通透性，进一步影响AMPA受体中介的突触传递功能。基于前期研究和预试验结果，我们推测术后疼痛期脊髓背角AMPA受体GluR1和GluR2亚基可能通过不同的功能调节机制导致突触后膜AMPA受体组分变化，从而有利于术后疼痛中枢敏化。为验证此假说，我们将采用免疫印迹、基因沉默、免疫共沉淀、分子克隆、融合蛋白表达与纯化等技术手段，研究AMPA受体亚基磷酸化、胞浆-胞膜转运和亚基突触靶向等功能调节机制在术后疼痛中的作用，并将构建细胞通透性小分子肽，干预AMPA受体亚基功能调节的关键环节，检测该小分子肽的镇痛效应。本研究项目将揭示术后疼痛的脊髓新机理，为研发靶向AMPA受体亚基功能调节、没有明显副作用的新型镇痛药物提供理论依据。

术后疼痛是外科病人最常见的症状，严重影响患者功能的恢复，是临床最需要得到治疗的一类疼痛。深入揭示术后疼痛的机理，发展针对新靶点的新型镇痛药物具有很大的必要性。目前研究发现鞘内应用AMPA受体拮抗剂有很强的术后镇痛效应。然而，术后疼痛中脊髓背角AMPA受体GluR1和GluR2亚基如何参与AMPA受体功能的调节尚没有研究。在本研究项目中我们采用免疫印迹、RNA干扰、免疫共沉淀、分子克隆、融合蛋白表达与纯化等技术手段，研究了GluR1丝氨酸磷酸化、GluR1和GluR2亚基转运、Stargazin与PSD-95相互作用中介的AMPA受体亚基突触靶向等功能调节过程在术后疼痛中的作用。我们还构建细胞通透性小分子肽，检测了该小分子肽的镇痛效应。研究发现：（1）术后疼痛期，手术同侧脊髓背角AMPA受体Serine-831位点（而非Serine-845位点）磷酸化水平明显提高。鞘内给予PKC抑制剂Go6983能明显抑制手术切口刺激诱发的AMPA受体Serine-831位点磷酸化和痛觉敏化。提示脊髓背角AMPA受体Serine-831位点磷酸化参与术后疼痛的发生发展。（2）手术切口刺激在诱发同侧脊髓背角AMPA受体GluR1亚基发生胞浆胞膜转运变化的同时，也诱发PKCgamma膜转位的变化，鞘内给予PKCgamma siRNA明显抑制切口疼痛刺激导致的PKCgamma膜转位，同时抑制同侧脊髓背角AMPA受体GluR1亚基发生胞浆胞膜转运和痛觉敏化。（3）手术切口刺激可导致同侧脊髓背角AMPA受体GluR1（而非GluR2）亚基发生胞浆胞膜转运变化。切口疼痛刺激还明显增加Stargazin蛋白与GluR1（而非GluR2）亚基的相互作用。鞘内给予Stargazin siRNA可明显下调Stargazin的表达，抑制Stargzin与GluR1的相互作用、脊髓背角AMPA受体GluR1胞浆胞膜转运和术后痛觉敏化。（4）术后疼痛期，脊髓背角PSD-95与Stargazin相互作用明显增强，鞘内给予TAT-Stargazin可明显抑制PSD-95与Stargazin的相互作用，同时抑制AMPA受体GluR1亚基突触靶向，抑制痛觉敏化。本项目研究揭示了术后疼痛的脊髓新机理，丰富了人们对术后疼痛发生机制的知识。发现了一些术后疼痛治疗的重要靶点，为发展新型镇痛药物和干预方法提供了理论依据。