沉默ILK基因对口腔癌相关成纤维细胞分化及促癌作用的影响

Oral squamous cell carcinoma is one of the most common malignancies in oral cavity. Due to the strong invasive ability and the tendency to earlier regional lymph node metastasis，the prognosis of the patients are unfavorable. In tumor microenvironment, carcinoma-associated fibroblasts are widely involved in regulating proliferation, invasion and angiogenesis of oral squamous cell carcinoma and promote its progression and metastasis. Our previous studies have found a significant correlation between the expression of Integrin-linked kinase and α-SMA in tumor stroma，however，the role of ILK on the differentiation and phenotype maintenance of oral carcinoma-associated fibroblasts is still unkonwn. Thus，through silencing ILK gene in normal oral mucosa fibroblasts and carcinoma-associated fibroblasts with lentivirus vector, we intend to disclose the effect of ILK on the differentiation and phenotype mainteinance of oral carcinoma-associated fibroblasts induced by OSCC cells. Meanwhile, through the establishment of the co-culture system in vitro and the nude mice xenograft model with co-implantation of oral squamous cell line and the fibroblasts, we wish to elucidate the effect of ILK-deficient fibroblasts on the biological behavior of implanted tumor and thereby provided theoretical basis for the gene treatment targeting ILK of the mesenchymal cells.

口腔鳞状细胞癌是口腔最常见的恶性肿瘤，由于其具有较强的局部侵袭能力和早期发生区域性淋巴结转移的倾向，口腔鳞癌患者的预后并不理想。在肿瘤微环境中，癌相关成纤维细胞（CAFs）广泛参与了口腔鳞癌的增殖、侵袭及血管生成，促进了口腔鳞癌的发展和转移。申请人在前期工作中通过对大量临床样本进行调查发现整合素连接激酶（ILK）与CAFs的标记物α-SMA在口腔鳞癌间质中的表达有明显相关性，但ILK对于CAFs分化的作用尚不明确。因此，本课题拟采用以慢病毒为载体的RNA干扰技术沉默正常口腔粘膜成纤维细胞（NFs）以及CAFs的ILK基因，明确其对口腔鳞癌细胞诱导的CAFs分化和表型维持的影响。同时,通过建立口腔鳞癌细胞和成纤维细胞共培养的体外模型和共移植的裸鼠移植瘤模型，进一步探讨ILK沉默后的CAFs对移植瘤生物学行为的影响，从而为以肿瘤间质细胞ILK为靶标的基因治疗奠定基础。

口腔鳞状细胞癌是口腔最常见的恶性肿瘤，由于其具有较强的局部侵袭能力和早期发生区域性淋巴结转移的倾向，口腔鳞癌患者的预后并不理想。在肿瘤微环境中，癌相关成纤维细胞（CAFs）广泛参与了口腔鳞癌的增殖、侵袭及血管生成，促进了口腔鳞癌的发展和转移。本项目阐释了整合素链接激酶蛋白（ILK）在正常成纤维细胞（NFs）向癌相关成纤维细胞转化过程中的重要作用，进一步明确了ILK对CAFs促癌作用的影响。首先，通过组织样本的免疫组化研究，我们发现：ILK、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）在部分口腔鳞癌间质中过表达，且二者的表达成正相关，α-SMA在间质中高表达的病例往往存在淋巴结转移及复发。其次，通过体外细胞实验，我们发现：ILK沉默后NFs和CAFs对于转化生长因子β1（TGF-β1）的反应减弱：细胞附着斑和细胞骨架形成未见明显增加，α-SMA表达未见明显升高，NFs和CAFs细胞收缩能力未见增强。ILK沉默后，TGF-β1诱导的Smad2磷酸化水平明显减弱。然后，通过人口腔鳞癌细胞与癌相关成纤维细胞体外交互作用模型，我们发现：共培养体系中，以ILK沉默组CAFs条件培养基孵育的口腔鳞癌细胞表达增殖相关蛋白Ki-67，侵袭相关蛋白MMP-2，MMP-9明显减少。最后，通过人口腔鳞癌细胞与癌相关成纤维细胞共移植的裸鼠移植瘤模型，我们发现：ILK沉默组，瘤体形成时间较晚，且体积较小，瘤体间质中α-SMA表达减少，肿瘤细胞表达Ki-67，MMP-2，MMP-9明显减少，肿瘤微血管密度降低。综上，ILK可能是TGF-β1诱导的NFs向CAFs转化及CAFs的表型维持的关键下游蛋白, 其作用可能是通过改变Smad2的磷酸化水平介导。ILK表达缺陷的CAFs对于口腔鳞癌细胞的体外增殖和侵袭的促进作用以及对裸鼠体内移植瘤形成的促进作用均受到了明显抑制。本项目首次将ILK作为口腔癌相关成纤维细胞的靶点。ILK沉默成功抑制了TGF-β1诱导的正常成纤维细胞向癌相关成纤维细胞的分化以及表型维持，进而抑制了口腔癌相关成纤维细胞的促癌作用。因此，ILK应该被作为治疗口腔鳞癌的有潜力的间质细胞靶点。