共存于极端嗜盐古菌Natrinema sp. J7-1中的二个溶原病毒及病毒－宿主间相互作用的研究

Although limited in isolate number, archaeal viruses have already represented abundant diversity. The study of archaeal viruses is providing reveal new insight into the origin and evolution of viruses, as well as viral classification. On the other hand, the documented haloarchaeoviruses are overwhelmingly isolated from environments, but rarely lysogenic viruses at present. We have isolated two membrane-containing lysogenic viruses SNJ1 and SNJ2 from haloarchaeon Natrinema sp. J7-1 by mitomycin C induction. The provirus of SNJ1 is the plasmid pHH205, and genome of SNJ2 integrate into host chromosome. SNJ1 can infect derivative strains J7-2 and CJ7 that free of plasmid pHH205, and produce plaques on their lawns. The morphology and the genome analysis revealed relatedness between SNJ2 and viruses isolated viruses from environment. And SNJ2-like proviruses are identified prevalent insertion in haloarchael chromosomes. MMC induction of strains containing different proviruses suggest there exit interactions between the two viruses. To expand our awareness for archaeal viruses, we intend to study on the biological properties of the two lysogenic viruses, and the relationships between viruses and their host cells. Our attempts will also set up methods for discovery and research on more archaeal lysogenic viruses.

迄今为止发现数量尚极其有限的古菌病毒群体却已展现了极为丰富的多样性，对它们的研究正使人们对病毒的起源、分类和对生命进化的影响形成新的认识。此外，目前报道的古菌病毒大多分离自环境，有关溶原病毒的研究尚很少。SNJ1和SNJ2是能共存于同一嗜盐古菌细胞的二个有包膜的古菌溶原病毒，其前病毒分别以质粒和整合在染色体上的方式存在。SNJ1能侵染染色体相同但不携带其前病毒质粒pHH205的菌株J7-2或CJ7，形成噬菌斑；而形态观察及基因组结构分析发现，SNJ2与分离自环境的一些古菌“烈性”病毒关系密切；在其它很多嗜盐古菌基因组上也预测到了SNJ2-like前病毒的普遍存在；前期实验还发现SNJ1和SNJ2之间可能存在相互作用。本申请拟对这二个新病毒的基本生物学特性、两病毒之间以及它们与宿主间的相互关系开展深入研究，进一步揭示古菌病毒的独特性质及生物学价值；並为发现更多的古菌溶原病毒奠定新的技术基础。

在全长的嗜盐古生菌温和病毒SNJ1的基础上构建了Natrinema－E.coli穿梭载体pYC-S。在进一步对全长穿梭载体进行缩短过程中确定了SNJ1的最小复制区为SHS片段（ORF3-ORF11-12），以此为基础构建的pYCJ-HH穿梭载体实现了在Nnm sp. J7中外源蛋白的表达纯化。此外，证实pYCJ-HH在Nnm sp. JCM 8980中也具备复制功能，暗示此穿梭载体可以广泛运用到Nnm属的遗传操作中。而在对SNJ1超感染免疫建立的关键调控蛋白的筛查中，我们找到其中的一个关键蛋白gp4，发现基于Nnm sp. J7染色体的复制区域构建的另一穿梭载体pFJ6在CJ7-F中单独表达ORF4蛋白就可以显著抑制SNJ1的侵染，抑制噬菌斑的形成，使宿主对SNJ1病毒产生了“免疫性”。基于PSI-BlastP和HHpre对于ORF4预测编码蛋白gp4进行序列分析，发现gp4预测与TA系统中的抗毒素蛋白具有30%-40%的相似性，且预测其含有SpoVT-AbrB结构域，类似于AbrB-like Swapped Hairpin结构，由一个α螺旋连接一对β发夹结构组成。由此推测gp4可能是作为一个全局调控因子，对多基因的转录水平具有调控作用，但gp4具体作用机制尚还不明确。另一方面，在对SNJ1病毒研究过程中，在J7-1菌株中又意外地发现了另一株温和病毒SNJ2，且发现SNJ2病毒的大量释放可能需要SNJ1的协助。SNJ2前病毒特异性整合在宿主染色体的tRNAmet处。在对IntSNJ2-type位点特异性重组元件进行了系统的分析和鉴定中，发现IntSNJ2-type整合酶是一类新的酪氨酸家族重组酶，广泛分布于嗜盐古菌基因组中。通过构建一系列原病毒和病毒缺陷株来鉴定SNJ2重组系统中的关键因子，发现IntSNJ2不仅是原病毒特异性切离和整合的关键因子，而且对原病毒胞内稳定维持具有重要作用。进一步实验发现IntSNJ2能够识别位点attBOP和attP′OB′独立高效催化切离反应；但在整合反应中，IntSNJ2需要病毒编码的两个小蛋白Orf2和Orf3的帮助，才能进行有效的重组反应。生物信息学结果表明IntSNJ2-type重组元件分布广泛。暗示其在嗜盐古菌中作为重要内在驱动力，推动了基因的进化和流动。