丘脑皮质环路HCN和TASK离子通道涉及全麻药物导致的慢波振荡分子机制

The cellular and molecular mechanisms of general anesthetics have not been elucidated. The research has experienced more than one century, put forward various theories and views, but are not completely accepted. In micro-level anesthetics can affect many ion channels, molecular targets; but the macro-studies indicate that eliminating of these proteins, ion channels only slightly change anesthesia actions. Recent studies have paid attention to the influence of anesthetics on the neural network, especially the views of increasing of EEG low frequency slow wave oscillation and inducing electrical signal interference across the brain by anesthetics attracted great attention, but we know little of how these changes caused by anesthetics. Based on the facts of important roles of thalamocortical loop on generating low frequency slow wave effect and some molecular candidate of anesthetics actions such as TASK, HCN and GABAA receptors are involved in the signal transferring in thalamocortical loop, we, therefore, propose that synergistic effect of anesthetics on TASK, HCN channels and GABAA receptors in the thalamocortical loop achieve the effect of general anesthesia, by increasing brain low-frequency slow wave generation, and interfering electrical signal connection between different areas of the brain. This proposal design and employ technologies of multi-electrode stimulation and recording, electroencephalogram in brain slices, dynamic patch clamp and computational neuroscience and method of double gene knockout mice to verify the above hypothesis, to explore the cellular and molecular mechanism of general anesthesia.

全麻药作用的分子机制一直没有被阐明。其研究经历了一个多世纪，提出了各种学说和观点，但都没有被完全接受。微观上观察到全麻药对很多离子通道、分子靶点都有作用；但宏观上剔除这些蛋白质、离子通道只是轻微改变全麻药的作用。最近的研究关注到全麻药对神经网络的影响，特别是全麻药通过增加脑电低频慢波振荡、干扰脑区的电信号联系的观点引起了极大关注，但全麻药怎样引起这些改变不得而知。本申请基于丘脑皮质环路在低频慢波振荡的重要作用以及一些被认为是全麻作用的候选靶蛋白比如TASK、HCN通道和GABAA受体均参与丘脑皮质环路的电信号传导的分析，提出全麻药通过影响TASK、HCN通道和GABAA受体在丘脑皮质环路协同作用增加低频慢波振荡的产生，干扰脑区之间的电信号联系从而达到全麻作用。本课题设计应用多电极刺激和记录、脑片脑电图、动态膜片钳和计算机神经科学技术和双基因剔除小鼠方法验证上述假设，探讨全麻作用的分子机制。

全麻药作用的分子机制一直未被阐明。其研究经历了一个多世纪，提出了各种学说和观点，但都没有被完全接受。微观上观察到全麻药对很多离子通道、分子靶点都有作用。但宏观上剔除这些蛋白质、离子通道只是轻微改变全麻药的作用。最近的研究关注到全麻药对神经网络的影响，特别是全麻药通过增加脑电低频慢波振荡、干扰脑区的电信号联系的观点引起了极大关注，但全麻药怎样引起这些改变不得而知。本课题根据前期研究结果，提出超极化激活的阳离子通道(HCN)和双孔背景钾通道（TASK）参与全麻药抑制丘脑皮质环路慢波震荡机制的假设。我们设计的课题得到了国家自然科学基金委的资助，在此基金资助下，我们简化了原来的科研设计，得到了非常有意义的研究结果。我们设计应用HCN、TASK基因剔除小鼠，和腺相关病毒（AVV）选择性HCN、TASK基因敲低小鼠，采用分子生物学技术、电生理膜片钳技术和在体脑电监测技术来验证我们的假设。首先应用western blotting检测了TASK和HCN在不同脑区的表达情况，发现TASK在海马区（CA1、CA3、DG）高度表达，并验证TASK-KO小鼠的TASK基因明显敲除。通过条件恐惧行为学检测，我们发现相较于WT小鼠，TASK-KO小鼠表现出对麻醉药致遗忘作用的抵抗，同时脑电信号中theta波、low-gamma波和慢波有着明显差异。随后，我们通过AVV技术敲低海马区CA1、CA3的TASK基因，在相同设置下的条件恐惧行为学检测中得到了与先前相同的结果。.在这个结果的基础上，我们设计使用电生理膜片钳技术检测全麻药对海马CA1、CA3和DG区神经元的HCN和TASK通道电流的影响。我们发现海马CA3神经元TASK电流符合TASK电流，剔除TASK基因的海马CA3神经元的TASK电流几乎完全消失。全麻药七氟烷可明显激活野生型小鼠海马CA3的TASK电流，而对剔除TASK基因的海马CA3神经元，七氟烷激活的TASK电流几乎很小。.这些研究结果明显证实了我们的假设，即海马TASK通道参与了全麻药调控脑电信号介导麻醉的作用（包括致遗忘）。我们的研究结果为进一步探索全麻机制提供了理论依据。