灵芝全生育期漆酶的功能与作用机制

The famous traditional Chinese medicine lingzhi is an important white-rot fungus.At present,the traditional cultivation of lingzhi encounters the serious diseases and decline of yield and quality.In this project, we aim to find out the effect and mechanism of the laccase on lingzhi in the whole growth period based on our related physiological research.The activity of laccase in different growth stages of lingzhi will be determined.The expression of laccase gene and the content of the active ingredient will be detected. The laccase at the different stage will be purified and the enzymology properties will be analyzed. The laccase gene and the regulatory elements associated will be studied.The signal transfer from the laccase to the active components synthesis will be studied.The elicitor inducing or inhibiting the laccase activity will be added to the substrates in order to prove the discovery. The objective of this project is to find out the relationship among the laccase，the morphogenesis and the active components . We will elucidate the effect of laccase on lingzhi life cycle,especially during the primordia development and fruit body initiation. We hope to promote the production and quality of lingzhi and change the traditional cultivation pattern by the laccase regulation.

灵芝是我国传统中医药宝库中的"瑰宝"，是一种白腐真菌。目前灵芝栽培生产上面临诸多问题。项目从漆酶的研究入手，目的是为改进灵芝传统的栽培方式。我们已有的研究揭示漆酶在灵芝全生育期起重要作用，本项目拟系统深入研究、充分揭示其功能和作用机制：探明栽培灵芝漆酶的变化，同时对灵芝漆酶基因及调控序列进行分析，阐明漆酶在灵芝全生育期中的作用，探索漆酶对灵芝生长发育的调控、形态建成的影响及活性成分生物合成的关联；通过人为调控漆酶表达、酶活力，改变灵芝生产周期，改进品质（外观形态及活性成分）。本项目从白腐真菌角度系统研究药用真菌灵芝漆酶的生理生化功能，理论上可以丰富白腐真菌的木质素降解理论，实践上可以改进灵芝传统的栽培方式，将为其他木腐类食药用真菌的优质高产培养提供新的思路和方法。

灵芝作为传统中药被中华民族使用的历史已近两千年。生活水平的提高促使人们对灵芝的需求日益增加。由于多年连作重茬，设施栽培灵芝的病虫害严重，灵芝的产量和质量下降。灵芝是一种重要的白腐真菌，漆酶在其生长过程中发挥着重要功能。研究的目的是人为调控漆酶表达，改变灵芝生产周期，改进品质。. 通过本项目的开展，获得的主要研究结果有：筛选出灵芝液体培养产漆酶最佳培养基及培养条件，测得漆酶活性单位为60.45U/ml，为基础培养基的25.72倍。对液体培养灵芝漆酶进行电泳分离、显示灵芝漆酶是单一酶，活性的升高与其表达量的增加呈正相关。经过一步盐析、两步层析，漆酶被纯化了49倍，比活力达到3571.4U/mg，得到电泳纯漆酶，其分子量为59.6KDa；以ABTS为底物时，Km值为9.02×10-6mol/L，在pH6.0-8.0的范围内较稳定；最适反应温度为45℃。测定了代料栽培灵芝生长发育过程中漆酶等活力变化，探明了漆酶在灵芝全生育期的酶活变化规律。不同栽培方式、不同生长发育阶段测定灵芝多糖和灵芝三萜酸显示：灵芝多糖、7种灵芝酸最大值出现在弹孢前期；段木栽培的灵芝多糖明显比代料高。灵芝全生育期不同阶段漆酶基因表达分析为探明漆酶表达与酶活性的关系，众多漆酶基因如何协调实施分解功能奠定了基础。灵芝漆酶生物学信息分析结果显示：通过该漆酶同源基因序列在灵芝基因组（CGMCC5.0026）中定位，Lcc6、lacc14和lacc15不能和灵芝基因组完全比对，其他12个漆酶同源基因均可在基因组中找到。根据灵芝漆酶同源基因预测蛋白质信号肽序列及理化性质，可按亲缘关系的远近分为4组。研究了铜离子对灵芝菌丝体生长、生物量、漆酶活性和基因表达的影响，预测LCC1可能是灵芝菌丝体合成漆酶的关键基因。. 项目从白腐真菌角度系统研究药用真菌灵芝漆酶的纯化、酶学性质、变化规律及生理生化功能，理论上了丰富白腐真菌木质素降解的生理理论研究，为改进灵芝传统的栽培方式，也为其他木腐类食药用真菌的优质高产培养提供新的思路和方法。